丙泊酚对胎儿型和α7烟碱型乙酰胆碱受体的作用*

赵雪莲 庄心良 安广权 高 雁 徐国辉 邢玉英

丙泊酚（Propofol）具有起效快、苏醒快，且恢复完善、能抑制呕吐等多种优点，现已广泛用于临床。丙泊酚因具有较高脂溶性,易通过胎盘屏障。烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）是对麻醉药敏感的配体门控型离子通道超家族（LGICS）成员之一。胎儿和新生儿的骨骼肌神经肌肉接头乙酰胆碱受体主要是胎儿型乙酰胆碱受体（γ-nAChR），其与成人型乙酰胆碱受体（ε-nAChR）有着完全不同的电生理特性。在众多神经烟碱型乙酰胆碱受体（N-nAChR）中，与认知、记忆和学习功能密切相关的主要有α7-乙酰胆碱受体（α7-nAChR）亚型。本实验排除丙泊酚在体内分布、代谢和蛋白结合的影响，应用脂质体转染技术在人胚肾293细胞（HEK293）的细胞膜上分别表达骨骼肌细胞神经肌肉接头后膜γ-nAChR和中枢神经系统α7-nAChR，从受体水平研究丙泊酚对γ-nAChR和α7-nAChR这2种受体亚型的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 采用无nAChR表达的HEK293细胞（购于上海中科院细胞所）作为重组nAChR的靶细胞。在37℃、含5%CO2的培养箱中用DMEM培养基（含10%小牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素及2 mmol/L谷氨酰胺）中培养。实验时，用0.25%胰酶消化传代于35 mm一次性培养皿，密度为1×105，培养24 h。

1.2 亚克隆目的基因 将含小鼠源性α、β、γ、δ和α7基因的原核细胞表达质粒Psp65α、Psp65β、Psp65δ、Psp64γ 和Psp64α7（美国索克生物研究所赠送）通过亚克隆技术连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1上。并用基因测序法鉴定连接是否正确。

1.3 HEK293细胞脂质体转染及功能鉴定 （1）将含有α、β、δ和γ基因的pcDNA 3.1质粒，以2∶1∶1∶1的比例与DMRIE-C Reagent（Invitrogen）脂质体混合于1 mL无血清培养基，孵育45 min后，铺于HEK293细胞上。（2）含有α7基因的pcDNA3.1质粒与DMRIE-C Reagent（Invitrogen）脂质体混合于1 mL无血清培养基，孵育45 min后，铺于HEK293细胞上。以上2种HEK293细胞培养24 h后加入含血清的培养基1 mL，再培养24 h后即可应用。同时，用不含目的基因的pcDNA3.1质粒转染HEK293细胞作为阴性对照，步骤同上。应用全细胞电压钳观察乙酰胆碱对脂质体转染的乙酰胆碱受体的作用。不含目的基因质粒转染的HEK293细胞，乙酰胆碱作用不能激发电流；而含目的基因的质粒转染的HEK293细胞，乙酰胆碱可激发电流。

1.4 膜片钳部分 记录转录后细胞的电流前，先以细胞外液（NaCl 140 mmol/L;KCl 5.4 mmol/L;CaCl21.8 mmol/L;MgCl21.0 mmol/L;HEPES 10 mmol/L;葡萄糖11.1 mmol/L；阿托品1 μmol/L；以NaOH调pH至7.4）替换细胞培养基。用PC-10微电极拉制仪（Narishige公司，日本）分两步将直径1.6～2.0 mm玻璃微电极毛胚拉制成微电极，再用MF-830微电极抛光仪抛光。电极内液为（CsCl，150 mmol/L；HEPES 10 mmol/L；EGTA 5 mmol/L；Mg-ATP 2 mmol/L；以CsOH调pH至7.3）。电极电阻为3～5 MΩ。应用全细胞电压-膜片钳，记录电流。电刺激脉冲的给出及电信号的采入均通过计算机程序pClamp 7.0及digidatal 1200转换器接口来完成。采样频率1 000 Hz，低通Bessel滤波0.5 kHz。电极阻抗3～5 MΩ，封接阻抗大于1 GΩ时，吸破细胞膜成全细胞状态。细胞持续以细胞外液1～2 mL/min灌注。

1.5 给药模式 实验膜钳制电压均设为-80 mV。因HEK293为非兴奋性细胞，从-100 mV～-40 mV的钳制电压不影响非去极化肌松药的效应[1-2]。预先用0.1 μmol/L～3 mmol/L丙泊酚平衡α7-nAChR和γ-nAChR作用的HEK293细胞30 s，再给予100 μmol/L ACh激动受体。给药前后做单用乙酰胆碱的对照。持续给乙酰胆碱4～5 s，记录峰电流。2次用药刺激间隔2～3 min，用细胞外液持续冲洗，以减少细胞脱敏感。

1.6 统计学处理 按改良Hill公式计算得浓度效应曲线。采用clampfit 10.0和origin 7.0进行数据分析。数据用均数±标准差表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

丙泊酚可降低100 μmol/L ACh激发转染后的HEK293细胞的γ-nAChR的内向电流。但不同浓度丙泊酚对γ-nAChR内向电流抑制差异无统计学意义（F=0.47，P>0.05）。0.1 μmol/L丙泊酚抑制 γnAChR达1/3，而3 mmol/L丙泊酚抑制率为37%。丙泊酚可抑制ACh激发转染后的HEK293细胞的α7-nAChR的内向电流，但不同浓度丙泊酚对α7-nAChR内向电流抑制差异无统计学意义（F=0.22，P>0.05）。0.1 μmol/L丙泊酚抑制 α7-nAChR为25%与3 mmol/L丙泊酚抑制率相近。相同浓度的丙泊酚对γ-nAChR的抑制均强于对α7-nAChR的抑制（P<0.05），见表1、图1。

表1 不同浓度丙泊酚对γ-nAChR和α7-nAChR内向电流的抑制作用±s）

表1 不同浓度丙泊酚对γ-nAChR和α7-nAChR内向电流的抑制作用±s）

*P＜0．05

组别γ-nAChR组α7-nAChR组t n56 3 mmol/L 0.37±0.10 0.25±0.04 5.46*1 mmol/L 0.39±0.15 0.17±0.04 5.23*100 μmol/L 0.48±0.15 0.21±0.04 6.20*10 μmol/L 0.44±0.11 0.23±0.05 5.55*1 μmol/L 0.47±0.12 0.22±0.05 6.34*0.1 μmol/L 0.34±0.10 0.25±0.03 5.76*F 0.47 0.22组别γ-nAChR组α7-nAChR组t n56

3 讨论

丙泊酚作为起效快、作用短暂的静脉麻醉药已较多用于临床产科和小儿的麻醉。但丙泊酚对新生儿和小儿神经系统和骨骼肌肌力影响还未确定。Gin[3]采取静脉推注丙泊酚2.0 mg/kg后再以6 mg/（kg·h）或9 mg/（kg·h）维持，胎儿娩出时脐动、静脉丙泊酚血药浓度分别为0.53～1.66 g/L和1.00～2.00 g/L，表明异丙酚能快速通过胎盘。袁爱武等[4]观察发现孕产妇应用丙泊酚，胎儿娩出30 min新生儿神经行为测定法（NBNA）评估2例新生儿出现嗜睡,导致行为能力中的2项、主动肌张力的3项以及觉醒度为0分。

烟碱型乙酰胆碱受体按不同亚基组成分为肌肉型乙酰胆碱受体和神经型乙酰胆碱受体。肌肉型乙酰胆碱受体介导机体神经冲动传导和骨骼肌肌肉收缩。胎儿和新生儿骨骼肌神经肌肉接头后膜乙酰胆碱受体主要是γ-nAChR。γ-nAChR由5个亚基组成，即2个α，1个β，1个δ和1个γ亚基[5]，散布于肌细胞膜表面，随着神经肌肉接头发育完善，逐渐为 ε-nAChR取代[3，6]。γ-nAChR和 ε-nAChR无论在受体化学结构还是电生理学上均有极大差别[7]。本研究结果表明临床相关浓度丙泊酚对乙酰胆碱激发的γ-nAChR电流有抑制作用。100 nmol/L丙泊酚能降低乙酰胆碱激发γ-nAChR的1/3电流幅度。但是100 nmol/L～3 mmol/L的丙泊酚对γ-nAChR电流抑制差异无统计学意义，提示丙泊酚对γ-nAChR抑制较弱且为非竞争性抑制。从另一方面表明丙泊酚对胎儿和新生儿骨骼肌肌力有一定的抑制作用。

α7-nAChR属于神经型乙酰胆碱受体，它由5个α7亚基单独组成同型受体。α7-nAChR是脑内主要的对α-金环蛇毒素（BTX）敏感的神经型乙酰胆碱受体。α7-nAChR主要分布于海马和下丘脑，与人体学习，记忆功能有关，可直接调节海马中间抑制神经元突触传递，也可调节突触前神经递质如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、色氨酸、多巴胺和乙酰胆碱的释放。海马突触前和突触后nAChR能增强全麻药的抑制作用从而产生健忘[8]。本研究结果显示临床相关浓度的丙泊酚对100 μmol/L乙酰胆碱激发的α7-nAChR电流有轻微的抑制作用，其抑制大小与丙泊酚浓度无关。3 mmol/L ACh对α7-nAChR电流的抑制率为1/4。表明α7n-AChR不是丙泊酚主要作用位点。

本研究排除整体研究中肌松药药效受个体差异、药物分布、结合和消除等影响，应用了2类重组受体，这样可排除其他因素影响，从乙酰胆碱受体水平研究丙泊酚的作用，结果证明丙泊酚对γnAChR和α7-nAChR都有抑制作用，抑制程度与丙泊酚的浓度无关。

[1]Pollard BJ,Jones RM.Interactions between tubocurarine,pancuronium and alcuronium demonstrated in the rat phrenic nervehemidiaphragm preparation[J].Br J Anaesth,1983，55(11):1127-1131.

[2]安广权,赵雪莲,高英超,等.罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对骨骼肌成人型和胎儿型乙酰胆碱受体的作用[J].天津医药，2008，32（3）：204-207.

[3]Gin T.Propofol during pregnancy[J].Acta Anaesthesiol Sin，1994，32(2):127-132.

[4]袁爱武，陈静，李雪梅，等.异丙酚用于剖宫产的胎盘转移和对新生儿的影响[J].中国现代药物应用，2008，2（18）：1-3.

[5]Kim KS,Chun YS,Chon SU,et al.Neuromuscular interaction betweencisatracurium and mivacurium,atracurium,vevuronium or rovuronium administered in combination[J].Anaesthesia,1998，53(9):872-878.

[6]Naguib M,Samarkandi AH,Bakhamees HS,et al.Comparative potency of steroidal neuromuscular blocking drugs and isobolographic analysis of the interaction between rocuronium and other aminosteroids[J].Br J Anaesth,1995，75(1):37-42.

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[8]Coates KM,Mather LE,Johnson R,et al.Thiopental is a competitive inhibitor at the Human α7 nicotinic acetylcholine receptor[J].Anesth Analg,2001，92(4):930-933.