钙蛋白酶活性对颅脑创伤大鼠海马神经细胞凋亡和学习记忆的影响

刘清军 张建宁 朱 军 李建民

脑缺血后由于细胞内钙超载而激活calpain，激活后的calpain在缺血性脑损伤后神经细胞的凋亡中发挥着重要的作用[1]。大量的研究表明颅脑损伤后神经细胞内存在着明显的钙超载[2]，但关于钙蛋白酶在颅脑损伤后神经细胞凋亡过程中的作用少见报道。本研究通过观察大鼠颅脑损伤后海马钙蛋白酶的活性对细胞凋亡以及学习功能的影响，进一步探讨脑创伤后神经细胞凋亡和学习记忆功能障碍的机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 钙蛋白酶抑制剂MDL 28170及溶血脑磷脂（lysocephalin）均为Sigma产品；TUNEL检测试剂盒（武汉博士德公司）；酪蛋白，β－巯基乙醇为Serva产品；乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），二硫苏糖醇（DTT）等其他试剂均为市售国产分析纯产品。

1.2 实验动物与分组 成年健康雄性SD大鼠120只购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量350～400 g，随机分为脑创伤组、治疗组、假手术组及对照组，前3组各36只分为伤后6、12、24、48、72 h 5个时相组，每亚组6只，余6只进行Morris水迷宫测试；对照组12只，其中6只行calpain活性测定及凋亡检测，另6只进行Morris水迷宫测试。

1.3 方法

1.3.1 给药方法 用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射，麻醉后对治疗组动物经侧脑室注射MDL 28170（10 μL），创伤组、假手术组及对照组按同样方法给予生理盐水（10 μL）。第2天复制动物模型。

1.3.2 大鼠重型闭合性颅脑损伤模型的制备 于致伤前0.5 h给大鼠经腹腔注射阿托品（0．1 mg/只），用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，按照Marmarou等[3]的自由落体方法复制重型闭合性颅脑损伤模型。假手术组仅切开头皮不致伤，对照组不做任何处理。各组在相应的时相点断头取脑，一侧海马组织进行calpain活性测定，另一侧制作切片进行凋亡检测；用于水迷宫测试的大鼠不处死。

1.3.3 calpain活性测定[4]取海马组织加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（β－mercaptoethanol 5 mmol/L，EDTA 0.1 mmol/L，DTT 10 mmol/L，lysocephalin 5 mmol/L）在冰浴上用玻璃匀浆器将其制成组织匀浆，3 000 r/min离心10 min（4℃），取上清液置4℃冰箱待测calpain活性。每个样品分成2管，总体积为200 μL，1管为无Ca2+体系，内含酪蛋白0.4 mg、12 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EGTA及上清液40 μL；另1管除用1 mmol/L CaCl2代替EGTA外，余内容物均相同。25℃反应30 min后依次向各管加入蒸馏水3.0 mL，考马斯亮蓝-G250染液（考马斯亮蓝-G250 0.05%，乙醇23.5%，磷酸42.5%）0.8 mL，充分混合10 min后于595 nm测吸光度（A）值。最后每个样品的calpain酶活性用各相应的无钙管A值减去有钙管所得差值来计算。各管calpain活性以△A（/h·mg protein）表示。蛋白定量采用Lowry法。

1.3.4 凋亡检测 严格按照德国BM公司（in situ cell death detection kit，AP）说明书操作，显色液采用BCIP/NBT。每次实验均设阴性对照，以PBS代替TUNEL标记反应混合液。凋亡阳性细胞核呈蓝紫色。采用CMIAS2真彩色医学图像分析系统(北京航空航天大学)和OLYMPUS摄像显微镜进行海马CA2区锥体细胞层凋亡阳性细胞记数（个/400倍视野）。

1.3.5 Morris水迷宫测试 用于水迷宫测试的大鼠于伤后第7、8、9、10天进行定位航行能力测试。Morris水迷宫由圆形水池和安全岛构成，水池分为4个象限，安全岛位于第4象限中央，由水迷宫图像监视系统自动跟踪、拍摄和统计大鼠后寻找到安全岛的潜伏期和轨迹。如在180 s内未找到安全岛，则潜伏期值记为180 s。每只大鼠每日测试1次，共测试4 d。每只大鼠入池位置在各象限边1/2弧度头朝池壁入水，每次入水的位置是随机的。伤后第11天进行空间探索能力（即搜索站台的轨迹）测试，在伤后第11天除去安全岛，任选一入水点将大鼠放入水中，记录大鼠3 min内在池中搜索安全岛的游泳轨迹。

2 结果

2.1 海马钙蛋白酶活性测定结果 创伤组大鼠海马在伤后6 h钙蛋白酶活性升高，于24 h达到高峰，72 h明显下降。治疗组较创伤组明显下调（P＜0.05），见表1。对照组及假手术组大鼠各时相点未检出海马钙蛋白酶活性。

表1 创伤组、治疗组各时相点海马钙蛋白酶活性比较[n=6，△A/（h·mg protein）]

2.2 神经细胞凋亡检测结果 对照组及假手术组各时相点海马区未见凋亡阳性细胞。创伤组大鼠伤后6 h海马CA2区即出现少量凋亡阳性细胞，24 h明显增多，72 h达高峰；治疗组与创伤组同时相点比较，伤后12、24、48、72 h凋亡阳性细胞减少差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

2.3 定位航行能力测试结果 重复测量方差分析结果显示F处理=9.352（P＜0.01），F时间=22.157（P＜0.01），F交互=1.551（P>0.05）。创伤组伤后8、9、10 d搜索安全岛潜伏期较对照组及假手术组明显延长。治疗组伤后8、9、10 d搜索安全岛潜伏期较创伤组明显缩短，搜索轨迹较创伤组理想，见表3。

表2 创伤组、治疗组各时相点海马CA2区神经细胞凋亡比较 （n=6，个/400倍视野±s）

表2 创伤组、治疗组各时相点海马CA2区神经细胞凋亡比较 （n=6，个/400倍视野±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

创伤组治疗组t时相组别12 h 11.12±2.45 7.78±1.56 2.817*24 h 17.67±3.97 9.75±1.47 4.583**48 h 21.43±4.13 13.46±2.03 4.242**72 h 27.89±5.16 15.52±2.61 5.240**6 h 5.34±0.87 4.78±0.86 1.121

表3 各组定位航行能力测试结果 （n=6，s，±s）

表3 各组定位航行能力测试结果 （n=6，s，±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

对照组（1）假手术组（2）创伤组（3）治疗组（4）q 1∶2 1∶3 1∶4 2∶3 2∶4 3∶4 7 d 175.24±31.65 174.98±32.12 177.14±35.27 175.75±37.38 8 d 119.97±21.15 120.55±22.76 167.27±27.91 132.24±21.67 0.046 4.925*1.278*4.864**0.911 3.647*9 d 49.76±10.43 50.19±11.13 143.57±21.38 75.89±14.56 0.070 15.304**4.263*15.234**4.193**11.041**10 d 20.23±4.13 22.09±4.22 82.89±13.63 39.43±7.22 0.552 18.586**5.695**18.035**5.143**12.891**时相组别

2.4 空间探索能力测试结果 对照组、假手术组、创伤组及治疗组第4象限的航行时间分别为（142.49±23.68）s、（140.24±21.45）s、（63.72±10.79）s及（101.38±19.46）s，差异有统计学意义（F=22.01，P<0.01），创伤组较对照组明显缩短（q=9.911，P<0.01），治疗组较创伤组明显延长（q=4.739，P<0.05）。

3 讨论

calpain属于半胱氨酸蛋白酶中番木瓜蛋白酶家族成员，根据对钙离子敏感性的不同可分为m型和μ型。calpain广泛分布于哺乳动物神经系统中的胞质、质膜和其他细胞器膜中，正常情况下以无活性的酶原形式存在。该酶不仅参与细胞内正常的信号转录，而且参与许多病理过程，包括颅脑损伤、脑缺血等神经元退变[1,5]。以往一直认为钙蛋白酶只引起神经元坏死，而最近的研究表明钙蛋白酶在脑损伤后神经元凋亡的过程中发挥重要的作用[6]。大量的研究已经证实颅脑损伤后存在神经细胞内钙超载，从而使钙蛋白酶激活，导致对细胞蛋白的选择性分解，如细胞骨架蛋白、钙调素结合蛋白，还有涉及信号传递的酶类如PKC等，对细胞蛋白的分解可以正反馈调节细胞质的Ca2+内流量。细胞质Ca2+内流量的增加和被激活的相关涉及信号传递的酶类，均最终激活Caspase途径产生级联反应，从而导致细胞凋亡[7]。大量的研究已经证实Caspase-3是细胞凋亡执行过程的关键蛋白酶。Blomgren等[8]利用脑缺血模型研究发现Caspase-3的激活可被钙蛋白酶抑制剂CX295显著抑制，而CX295对Caspase-3本身并无抑制作用，说明Caspase-3的激活与钙蛋白酶有关。已有学者研究证实颅脑损伤后不仅出现calpain的激活，同时还伴有calpain表达增加[9]。本研究显示大鼠颅脑损伤后海马区在伤后6 h钙蛋白酶活性升高，于24 h达到高峰，其高峰先于伤后海马神经细胞凋亡的高峰，说明calpain的激活可能在颅脑损伤后神经细胞凋亡发挥重要作用。

钙蛋白酶抑制剂MDL 28170是人工合成的肽类钙蛋白酶抑制剂，具有高效性、特异性及较好的膜穿透性等优点。有学者利用液压打击模型研究发现钙蛋白酶抑制剂MDL 28170能够有效地保护脑损伤后胼胝体的结构和功能[10]。新近有研究证实椎管内注射钙蛋白酶抑制剂MDL 28170能够有效地保护脊髓损伤后脊髓的结构和功能[11]。学习记忆是人类赖以生存不可缺少的重要的脑功能之一，海马是记忆储存的关键结构。近年来，分子生物学研究发现，海马作为脑损伤后选择易损区，伤后出现神经细胞凋亡，从而出现长期学习记忆功能障碍[12]。本研究中，伤前1 d经侧脑室注射MDL 28170（10 μL）能够有效地使伤后海马神经细胞凋亡的高峰明显下调，同时学习记忆功能亦显著改善。该结果进一步提示，calpain的激活可能参与了颅脑损伤后海马神经细胞凋亡和学习记忆功能障碍的过程，钙蛋白酶抑制剂可能是治疗颅脑损伤的有效药物。

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