β-乳球蛋白IgG抗原决定簇的识别

丛艳君， 任发政， 云战友

(1. 北京工商大学 化学与环境工程学院, 北京 100048; 2. 中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083; 3. 内蒙古伊利实业集团股份有限公司， 内蒙古 呼和浩特 010080)

乳及乳制品是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的8大类食品之一，β-乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原[1-2]. 食物过敏反应的免疫学物质基础是过敏原抗原决定簇(作用表位)的存在，即过敏原参与结合抗体的组成部分[3]. 牛乳过敏原的表位是备受关注的研究热点之一，研究成果可以指导无过敏和低过敏的乳制品的开发.

食物过敏反应一般是由免疫球蛋白IgE介导的，但是一些研究表明，免疫球蛋白IgG在牛奶过敏疾病中发挥重要的作用. IgG介导牛奶过敏的机制还不是很清楚，但是研究发现在一些持续性牛乳过敏患儿和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量显著高于正常水平[4-6].

本实验应用固相合成肽的方法合成β-乳球蛋白多肽，以收集到的牛乳过敏患者血清中的IgG为探针，鉴定β-乳球蛋白IgG抗原决定簇，探讨牛乳过敏机理.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-乳球蛋白多肽，实验室合成；链霉亲和素(Streptavidin,SA)，北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记的兔抗人IgG(二抗)、四甲基联苯胺(TMB)，美国Sigma公司；96孔聚苯乙烯酶标板，美国Costar公司.

1.2 仪器与设备

BIO-RAD550型酶标仪，BIO-RAD公司；PSH500A生化培养箱，中国重庆银河实验仪器有限公司；F-32酸度剂，日本崛厂制作公司；Th-80D-2B型冻干机，北京天地精仪科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[7]

采用Fmoc固相肽合成法，将C-末端氨基酸连接到一种合适的固相载体上，采用常规Fmoc法进行逐步缩合，合成结束后，用强酸将序列从固相载体上切割下来，经HPLC纯化，冷冻干燥后备用.

1.3.2 合成肽的纯化和鉴定

合成的多肽用高效液相色谱进行纯化，多肽的纯度用质谱进行分析. 色谱柱： C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：A为体积分数0.1% TFA的水溶液，B为15%～40%的乙腈, 梯度洗脱，流速：1.0 mL/min，检测波长：220 nm，柱温：20 ℃. 质谱条件：采用ESI离子源，喷雾压力0.1 MPa，干燥气温度350 ℃，流速5 L/min，扫描质量范围：500～2 200 m/z.

1.3.3 牛奶过敏患者血清的收集

6份牛乳过敏患者血清用来识别β-乳球蛋白IgG抗原决定簇，以A-F表示.

1.3.4 酶联免疫(ELISA)识别抗原决定簇

合成肽致敏性的检测是在96孔微板上进行的，每孔均先用链霉亲和素包被，分别依次加入待进行抗原决定簇鉴定的肽系列，再用抗体检测[8].

操作步骤如下：

1) 冻干的肽溶于体积分数为100%二甲基亚砜(DMSO)中，使其贮存液的质量浓度为10 g/L，工作液的终质量浓度为1 g/L，贮存于-70 ℃.

2) 用质量浓度为5 mg/L链霉亲和素(去离子水稀释)包被96孔板每孔50 μL.

3) 用0.1%PBS-Tween(0.05%)洗板4次，用质量浓度为20 g/L的BSA/PBS封闭非特异性结合位点，室温2 h.

4) 将肽用质量浓度为1 g/L BSA/PBS稀释至终质量浓度为20 mg/L，每孔加入50 μL肽溶液，4 ℃孵育过夜，未加肽溶液的孔作为对照组.

5) 加入用质量浓度为1 g/L的BSA/PBS稀释4倍的牛奶过敏患者血清孵育2 h.

6) 吸去抗体溶液，用洗涤液洗板4次，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(用BSA/PBS作1/800稀释)，孵育2 h.

7) 洗板4次，加入TMB底物，每孔50 μL，出现蓝色时(30 min)，加入浓度为100 mmoL/L硫酸50 μL终止反应. 在450 nm波长下测其光密值(OD值).

2 结果与讨论

2.1 合成肽

以β-乳球蛋白氨基酸序列为模板，用Fmoc固相合成法错位合成β-乳球蛋白30条，结果如表1.

2.2 合成肽的纯度鉴定

合成的多肽通过高效液相纯化，纯度都达到了80%以上，进一步通过质谱鉴定多肽的相对分子质量(加上生物素的相对分子质量)，表明多肽相对分子质量误差均小于5%. 本实验代表性的附上了两条多肽(偶联生物素)的质谱图，如图1、图2.

2.3 IgG抗原决定簇的识别

图3为A牛乳过敏患者识别β-乳球蛋白IgG抗原决定簇. 由图3可以看出，A患者识别到的抗原决定簇为B01,B02,B06,B10,B15,B22,B27,B28.

表1 合成肽氨基酸序列

图1 生物素标记多肽(Biotin-LIVTQTMKGLDIQKV) 的质谱图Fig.1 MS profile of the peptide with the sequence of LIVTQTMKGLDIQKV coupling biotin

图2 生物素标记多肽(Biotin-TKIPAVFKIDALNEN) 的质谱图Fig.2 MS profile of the peptide with the sequence of TKIPAVFKIDALNEN coupling biotin

图3 A牛乳过敏患者血清识别β-乳球蛋白IgG 抗原决定簇Fig.3 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from A cow milk allergenic patient

图4为B牛乳过敏患者识别β-乳球蛋白IgG抗原决定簇. 如图4，B患者识别到抗原决定簇为B03,B06,B12,B18,B23.

图4 B牛乳过敏患者血清识别β-乳球蛋白 IgG抗原决定簇Fig.4 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from B cow milk allergenic patient

由图5可知，C患者识别到抗原决定簇为B02,B08,B16,B23.

图5 C牛乳过敏患者血清识别β-乳球蛋白IgG 抗原决定簇Fig.5 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from C cow milk allergenic patient

图6为D牛乳过敏患者识别β-乳球蛋白IgG抗原决定簇. 由图6可以看出，D患者识别到抗原决定簇为B02,B12,B23,B30.

图6 D牛乳过敏患者血清识别β-乳球蛋白IgG 抗原决定簇Fig.6 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from D cow milk allergenic patient

由图7可知，E患者识别到抗原决定簇为B02,B06,B12,B23,B28.

图7 E牛乳过敏患者血清识别β-乳球蛋白IgG 抗原决定簇Fig.7 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from E cow milk allergenic patient

图8为F牛乳过敏患者识别β-乳球蛋白IgG抗原决定簇. 由图8可知，F患者识别到的抗原决定簇为B02,B26.

由图3～图8可知，6位牛乳过敏患者识别的β-乳球蛋白IgG作用表位的结果差异较大，以6位牛乳过敏患者全部识别到的结果为100%，则牛乳过敏患者对编号B02多肽的识别率为83.3%(5/6)，对B23的识别率为66.7%(4/6)，B06，B12的识别率为50%(3/6)，B28的识别率为30%(2/6)，B01，B08，B10，B15，B16，B18，B22，B26，B27，B30的识别率为16.7%(1/6). B02，B23的识别率在60%以上，为研究β-乳球蛋白IgG抗原决定簇，其氨基酸序列为TMKGLDIQKVAGTWY, AEPEQSLACQCLVRT,它们在乳球蛋白中的氨基酸序列定位分别为aa22-36, aa127-141，如表2划横线部分. 用非牛乳过敏患者血清识别抗原决定簇的结果作阴性对照，其吸光度值均低于0.1(本论文未附具体数据).

表2 抗原决定簇在β-乳球蛋白氨基酸序列中的定位

3 结论与展望

目前对β-乳球蛋白IgG表位的研究较少，只确定了6个识别位点：肽链1-16位，51-64位，67-88位，85-96位，129-144位，139-156位，其中1-16位和58-96位为次要识别位点，其余为主要识别位点[9-10]. 本研究识别到的抗原决定簇aa127-141与肽链129-144位是一致的，抗原决定簇aa22-36是以前没有报道过的. 由于收集牛乳过敏患者血清的困难性及所需时间的长期性，本研究只是进行阶段性探索，今后将继续开展这方面工作.

IgG介导牛乳过敏的机制还不是很清楚，开展IgG抗原决定簇识别工作是个重要的突破口. β-乳球蛋白大多数IgG作用表位是IgE作用表位的片段，虽然IgG与这些表位的结合能力较低能够解释这种现象，但是更重要的原因是产生IgG的抗原决定簇可能不同于产生IgE的[10]. 更有研究表明：IgG主要识别构象抗原决定簇，而正常人血清既可以识别构象抗原决定簇又可识别线性决定簇[11]，这方面有待于深入研究，也是未来研究工作的重点. 另外发现，一些牛乳过敏患儿3～4岁之后，会发生免疫耐受，血清中IgG4含量明显升高[12],这为牛乳过敏的临床治疗提供了思路，而本研究识别到的IgG作用表位可为诊治探针的制备提供理论依据.