乌梅丸治疗溃疡性结肠炎方证相应的实验研究

卢贺起，张 玲，岳广欣，刘丽梅，王瑞海，陈 琳

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

中医研究中的方证相应研究，特别是动物中的实验研究一直是中医基础研究中的一个热点，如何认识、研究都是亟待探索的领域之一［1］。本实验选择中医临床中治疗溃疡性结肠炎疗效明确的经典名方乌梅丸及加味方做对象，观察实验性大鼠溃疡性结肠炎(UC)、化学性刺激模型和免疫化学性复合模型中，研究对象对炎症相关因子IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子 TNFα和 PGE2因子及细胞间黏附因子(ICAM-1)的影响，初步探讨其治疗效果中中医方证相应的内涵或依据。

1 材料

1.1 动物

健康SD清洁级大鼠120只，均为雄性，体重250g±20g，购于军事医学科学院实验动物中心，饲养和实验均在中国中医科学院基础所清洁级动物实验室。

1.2 药物

乌梅丸按《伤寒论》、七味白术散按《小儿药证直诀》、芍药汤按《素问病机气宜保命集》组成药味。药液制备按常规煎煮去渣，煎液浓缩制成含生药2g/ml的水煎液;中药番泻叶同法制成0.4g/ml浓度的水煎液。柳氮磺胺吡啶(SASP)为上海三维长江生化制药厂产品，批号20080907。

1.3 试剂和试剂盒

麻醉剂戊巴比妥钠配1% 浓度(批号020919，德国进口分装);软皂液:0.5% 浓度(抚顺化工一厂，批号920605);乙酸配8%浓度。脱毛剂:取BaS.10g加100ml蒸馏水，用适量面粉调成糊状，(BaS:面粉 =1∶2)。致敏剂Ⅰ:2.4-二硝基氯苯(DNCB天津市光复精细化工研究所，化学纯)1g加100ml丙酮;致敏剂Ⅱ:2.4-二硝基氯苯(DNCB)1g加100ml95%乙醇。IL-6、IL-10、TNFα、PGE2的检测试剂盒为美国 SUNBIO公司产品，批号090108、0901081、0903021、0903607 等。

1.4 主要仪器

电子天平，AR2130梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司制造;酶标仪，MK3型 Thermo(上海)仪器有限公司;洗板机4MK2型，热电(上海)仪器有限公司;离心机 LXJ-ⅡB型，上海安亭科学仪器厂;MPT电泳和MTB转印系统，BioRAD公司产品等。

2 方法

2.1 大鼠溃疡性结肠炎化学性刺激模型的制备

2.1.1 模型制备 将SD大鼠60只，随机分为正常组、模型组、西药对照组、乌梅丸组、乌梅丸加七味白术散组、芍药汤组共6组。在实验第2天正常组给水，其他组给番泻叶1ml/100g灌服，连续3d。在第3天所有组腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉(25mg/kg)，之前24h禁食给水，再用0.5%软皂液2.5ml/只洗肠，1h后以直径3mm导尿管经肛门插入结肠8cm处，正常组注入生理盐水，其他组肛门注入8%乙酸1ml/只，倒置30s均不冲洗放回笼中。每天观察大鼠大便性状、饮食、毛发、活动状态等，可以看到大鼠逐渐产生典型UC活动期症状。给药方法:各中药组每组每只大鼠分别用以上配制的乌梅丸液、乌梅合七味白术散液、芍药汤1ml/100g灌胃;SASP组:每只大鼠用SASP混悬液0.9ml/100g灌胃;模型组、正常组:每只大鼠均以蒸馏水1ml/100g灌胃，以上均每天1次，连续给药7d。

2.1.2 样品采集与检测 采样当天分别断头处死全部动物，在冰浴下取整段结肠(6cm～8cm)纵向剪开，距肛门6cm处取0.5cm长的结肠，制成0.1g/ml生理盐水组织匀浆液，以4℃、12500r/min离心15min，取上清液置于－78℃冰箱冻存待测。测定 IL-6、IL-10、TNFα 和 PGE2，均采用 ELISA 试剂盒检测，严格按试剂盒使用说明进行。

2.2 大鼠溃疡性结肠炎免疫化学性复合模型的制备

2.2.1 动物分组同上。将大鼠颈背部用脱毛液脱毛后，以1%DNCB丙酮液0.25ml滴背，1次/d，连续14d。在第15天正常组给水，其他各组给番泻叶灌胃，1ml/100g连续3d，在第18天所有组禁食给水24h后麻醉，洗肠同上。正常组注入95%乙醇，其他组注入1%DNCB乙醇0.25ml/只，1h后注入8%乙酸1ml/只，倒置30s均不冲洗放回笼中。再饲养15d，每天观察大鼠大便性状、饮食、毛发、活动状态等，待到大鼠逐渐产生典型明显的UC活动期症状。给药方法同上，连续给药15d。

2.2.2 样品采集与检测 样品采集和检测方法同上。

2.2.3 细胞间黏附因子(ICAM-1)的检测方法

于采样时在冰浴下剪开同一结肠组织取约0.5g后，将其至于冰浴上剪碎，放于1ml裂解液中，进行组织研磨，呈乳状后统一离心。条件:4℃ 20min 12500r/min。每个样品取0.5ml上清液4℃冰箱放置。样品蛋白定量，步骤按试剂盒要求进行，统一调整蛋白浓度。电泳分离、转印和检测样品:选Actin为内参，采用化学发光法成像，再通过成像仪计算各组的成像素，用像素值的高低反映ICAM-1表达的强弱。

2.3 统计学处理

采用SPSS10.0版软件处理其数据资料，计量资料数据采用均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析结合q检验，如是计数资料应用 RIDITER法检验并分析各组数据。

3 结果

3.1 乌梅丸及加味方对大鼠化学性刺激引起UC的影响

3.1.1 乌梅丸及加味方对细胞因子IL-6、IL-10的影响 表1显示，模型组与正常组比较，IL-6浓度有上升并有统计学差异(P<0.01)，IL-10浓度有下降趋势(P<0.05)，符合UC发作期炎症的发生特点。给药各组与模型组的IL-6值比较，有显著性差异(P<0.01);而IL-10中药各组有升高的趋势，说明各药物均在机体内发生了抗炎调节作用，乌梅丸作用较强。

表1 乌梅丸及加味方对细胞因子IL-6、IL-10的影响 pg/ml

3.1.2 乌梅丸及加味方对肿瘤坏死因子TNFα及PGE2因子的影响 表2显示，模型组与正常组比较，TNFα、PGE2浓度都有上升趋势并具有统计学差异(P<0.01)，符合UC发作期炎症的发生特点。乌梅丸组与模型组的TNFα值比较，统计学计算有显著性差异(P<0.05)，其他中药各组也有降低趋势。PGE2指标各中药组都有降低趋势(与模型组比较)，但相互间无统计学差异。总之，各药物均在机体内发生了抗炎调节作用，但中药组间差别不明显。

表2 乌梅丸及加味方对肿瘤坏死因子TNFα及PGE2因子的影响 pg/ml

3.2 乌梅丸及加味方对大鼠免疫化学性引起的UC影响

3.2.1 对免疫化学性引起的大鼠UC细胞因子IL-6、IL-10的影响 表3显示，模型组与正常组对比IL-6浓度有升高趋势，而给药各组有降低作用，乌梅丸及乌梅加味组具统计学差异;且中药各组与模型组比较都有统计学意义，以乌梅丸效果最强。IL-10指标表明，模型组表现出降低，而给药各组与模型比有升高，乌梅丸组与模型组比有统计学差异，且与芍药汤组间有作用强弱的统计学差异。

表3 免疫化学性引起的UC大鼠细胞因子IL-6、IL-10 的变化(pg/ml)

3.2.2 对免疫化学性引起的大鼠UC肿瘤坏死因子 TNFα、PGE2的影响 表4显示，模型组TNFα值与正常组对比有显著性升高，其他给药各组都有下降的作用或趋势，乌梅丸组作用最强，而芍药汤组最弱，且有统计学差异。PGE2指标说明:模型组表现出降低现象，而给药各组均有上升趋势(与模型组比)，乌梅加味组、乌梅丸组与模型组相比有明显的统计学差异，且接近正常组值。

综合评价:各中药复方均在机体内发生了降低IL-6，升高 IL-10，对抗 TNFα的作用，调节 PGE2的效果，表现出抗炎的药效作用。而中药各组间，乌梅丸组作用较强，与乌梅加味组作用强度无明显区别，而芍药汤组较弱，且有统计学差异。

3.2.3 细胞间黏附因子(ICAM-1)的检测结果以正常组的ICAM-1像素为1，计算各组与其的像素比值，然后做图进行比较(见下图)。

分析表明，模型组的ICAM-1表达较正常组明显升高，乌梅丸组最低有抑制其表达的作用，西药组、乌梅加白组次之，而芍药汤组未观察到明确作用。

4 结论

通过研究表明，应用番泻叶灌服致泻、乙酸的化学性损伤可以引起大鼠UC发作期的病理表现;而增加2，4-二硝基氯苯引起大鼠的免疫过敏反应因素，使所造成的大鼠腹泻更具有临床 UC特点［2、3］，基本符合本研究观察大鼠UC病理改变的需要。

实验表明，在化学性刺激引起大鼠UC的实验中，乌梅丸及加味方与对照药芍药汤，均具有抗炎的药效作用，但其之间无明确的统计学差异，仅有一点趋势。而在免疫化学性引起的大鼠UC中乌梅丸的抗炎药效优势明显，可降低IL-6，升高 IL-10，对抗TNFα的作用和调节 PGE2的效果;减轻 UC时ICAM-1的表达程度，并与芍药汤之间有明确差异，证明了该方的抗炎药效及影响ICAM-1表达，部分阐明了临床治疗UC的机理。

本研究的目的是想找到乌梅丸及加味方临床治疗UC的中医方证相应变化的依据。临床上该方确能治疗UC疾病，其加味七味白术复方也有作用［4］。但实验证明，两者在抗炎药效指标上无明显的量效区别，不如临床明确，特别是在单纯化学性刺激下，这可能与动物研究无法完全反应人体的状况有关。而乌梅丸作用明显优于芍药汤的作用，在一定程度上说明了两方虽然在临床上都可治疗UC这单一疾病［5］，但依照中医临床辨证两方存在适应证候的不同，在一定程度上达到了本项研究的目标。

中医方证相应的研究是一项非常复杂的研究领域，如何科学、合理的进行研究，才能具有实际的应用价值，在目前仍是无明确答案，本项研究仅是一个摸索，是否合理仍应加以深入探讨。

［1］张兰凤，王阶，王永炎.方证对应研究［J］.中华中医药杂志，2005，20(1):8-10.

［2］李杨.溃疡性结肠炎动物模型的建立方法［J］.中药新药与临床药理，1999，10(2):120-122.

［3］范恒，邱明义.溃疡性结肠炎大鼠实验模型的建立与评价［J］.中医药学，2004，22(5):865-867.

［4］熊俊，董文军，宋俊生，商铁刚，袁安，徐阳.乌梅丸及其加减方治疗溃疡性结肠炎临床随机对照试验的系统评价［J］.吉林中医药，2008，28(4):296-299.

［5］胡响当，何永恒.芍药汤合痛泻要方治疗湿热内蕴型溃疡性结肠炎35 例［J］.中医杂志，2009，50(3):235-236.