犬外周血基质细胞的分离培养及其横向分化潜能研究

韩 雪 刘洪臣 王东胜 苏 方 孙 斌 吴 霞

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作为成体干细胞领域研究较多的一类干细胞，在细胞治疗、基因治疗及组织工程领域具有重要的临床应用价值。但骨髓的抽取过程患者不易接受，而且数量极少，1×106个骨髓单个核细胞中仅有1个BMSC[1]，且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞数量逐渐减少，使获取大量的BMSCs受到限制。外周血来源的基质细胞(peripheral blood stromal cells，PBSCs)与BMSCs有很多相似的特性，同时又具有来源丰富、较易获取、自体移植时无免疫排斥等诸多优点，日益突显出在细胞治疗和组织工程领域的优势,具有广泛的研究价值及广阔的临床应用前景。

目前，虽然对PBSCs的研究取得了一定的成果，但仍有许多问题有待于进一步阐明。例如，对细胞的生物学特性认识还不全面，如何有效获取以及其体内、体外的分化潜能尚需要更多研究结果的证实。鉴于此，本实验以犬为研究对象，对PBSCs的分离培养、横向分化潜能进行系统性研究，从而为其作为种子细胞的相关实验研究奠定基础。

1.材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性杂种犬1只，身体健康，体重约15kg，解放军军医进修学院医学实验动物中心提供并饲养。

1.2 主要实验试剂和设备 淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，α-MEM培养液、FBS、L-谷氨酰胺(美国Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美国Amresco公司)，β-甘油磷酸钠、胰岛素、地塞米松、引哚美辛、IBMX、抗坏血酸(美国Sigma公司)，小鼠抗人CD34、CD105单克隆抗体(北京中杉金桥公司)，OPN抗体(美国Santa Cruz公司)，超敏鼠二步法检测试剂(北京中杉金桥公司)。

CO2恒温孵箱(美国Thermo Forma公司)，超净工作台(北京昌平净化设备厂)，倒置相差显微镜(德国 Leica 公司)。

1.3 PBSCs的分离与原代培养[2]取成年犬，剪除前肢毛发，碘伏消毒，肝素化注射器穿刺入静脉抽血，约15-20mL。用等量培养基稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液表面，离心20min。收集中间云雾状的单个核细胞带，α-MEM完全培养液重悬，清洗3次。以5×106/mL密度接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的α-MEM完全培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养，每隔3天进行换液。

1.4 传代培养 PBSCs原代培养至贴壁细胞生长近融合后，倾倒培养液，PBS液漂洗两次，加入0.25%的胰蛋白酶浸润瓶底细胞，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。消化约1min后把培养瓶放置显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，终止消化，按1∶2比例进行接种，置于培养箱中继续培养，次日更换培养基一次，倒置显微镜下观察细胞的生长增殖情况以及形态变化。

1.5 免疫细胞化学染色 取P4代PBSCs细胞消化，接种于预先放置盖玻片的6孔板内，常规培养4天后，4%多聚甲醛固定20min，PBS代替一抗为空白对照，免疫细胞化学染色方法行CD34和CD105染色。

1.6 犬PBSCs的横向分化

1.6.1 成骨诱导

取P4代PBSCs细胞消化，接种于预先放置盖玻片的6孔板内，用普通完全培养液培养，分为实验组和对照组。待细胞长到50%融合后，实验组更换为成骨诱导液（10-8mol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油酸钠，50mg/L抗坏血酸），对照组继续用普通完全培养液培养。培养14天后，95%乙醇固定，免疫细胞化学染色观察OPN表达情况；培养28天，茜素红染色观察矿化结节形成情况。

1.6.2 成脂诱导

取P4代PBSCs细胞消化，接种于预先放置盖玻片的6孔板内，用普通完全培养液培养，分为实验组和对照组。待细胞长到50%融合后，实验组更换为成脂诱导液(1μmol/L地塞米松，10 mg/L胰岛素，0.2 mmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX)培养，对照组继续用普通完全培养液培养，倒置相差显微镜观察诱导后的细胞形态变化及胞内脂滴形成情况。每 2-3天对细胞换液，10-14天后根据分化的情况用10%福尔马林固定进行油红O染色。

2.结果

2.1 倒置相差显微镜观察 原代培养前 3天细胞多处于悬浮状态，贴壁细胞少，形态以圆形或椭圆形为主。之后开始出现部分贴壁细胞，呈短梭形，分布不均。7天后贴壁细胞逐渐增多，细胞集落开始出现，部分细胞开始伸展成长梭形。13-16天时细胞集落扩大较明显，细胞以梭形及多边形为主(图 1-a)。

原代培养成功的PBSCs细胞按1∶2的比例进行传代培养，48-72小时后绝大多数细胞贴壁，PBSCs呈纺锤形生长，形态较原代时均一(图1-b)，生长速度也较原代有所增快，约3-4天时再次传代。此后的P2、P3代的纯度变高。

2.2 细胞免疫化学染色结果 外周血基质细胞表达CD105(图2-a)，不表达CD34(图2-b)。

图1-a 原代PBSCs培养至13天，细胞集落扩大较明显，细胞以梭形及多边形为主(×100)

图1-b 传代PBSCs，细胞生长旺盛，形态均一，多数细胞呈纺锤形(×100)

图2-a 外周血基质细胞CD105染色阳性(×200)

图2-b 外周血基质细胞CD34染色阴性(×200)

2.3 成骨诱导 成骨诱导培养14天可见细胞复层生长，局部增厚，细胞呈重叠生长，OPN免疫化学染色阳性(图3-a)。培养28天茜素红染色见深红色斑块，为钙盐特征性染色(图3-b)。

图3-a PBSCs成骨诱导14天，OPN染色胞浆可见棕黄色颗粒(×100)

图3-b PBSCs成骨诱导28天，茜素红染色(×100)

2.4 成脂诱导 PBSCs经成脂诱导液诱导10天左右有少量脂滴出现，14天脂滴量显著增加，油红O染色呈阳性(图4)。

3.讨论

本研究体外培养犬外周血基质细胞(PBSCs)，检测其表面标志物及其横向分化潜能，为后续研究提供理论依据。PBSCs较其他来源的基质细胞有可反复取材、方便、安全、不需麻醉、对病人造成痛苦少等优点，因此近年来被广泛关注。

图4 PBSCs成脂诱导2周，油红O染色阳性(×100)

迄今为止，许多研究证实多种哺乳动物包括兔[3,4]、狗[5]、鼠[6]、马[7,8]和人[6,9]的外周血都存在基质细胞。但也有一些研究没有检测到PBSCs[10,11]，分析其原因主要是因为外周血中的基质细胞含量极低，骨髓基质细胞占单个核细胞的总数的0.001%-0.01%[12]。与BMSCs相比，PBSCs细胞克隆形成率更低，小鼠约1/106单个核细胞，兔约1/107单个核细胞，而人仅1/108单个核细胞[6]，另外也与研究中所采用的原代培养方法(包括分离方法和培养基)、动物模型(包括种属、年龄、体重以及预先进行动员情况)的选取有关。

由于基质细胞具有在塑料培养板上贴壁生长的特性，本实验采用淋巴细胞分离液，利用密度梯度离心法并结合贴壁分离筛选法来分离纯化外周血基质细胞，将两者的优点结合起来，有效的避免了一些缺陷。所获取的PBSCs在原代培养的5天左右开始出现部分贴壁细胞，呈短梭形。7天后贴壁细胞增多，细胞集落开始出现，部分细胞开始伸展呈长梭形。13-16天时细胞集落扩大明显，细胞以梭形及多边形为主(图1-a)。可见PBSCs的细胞贴壁较晚，分离效率较骨髓明显低下，这也是制约PBSCs临床应用的主要原因。

目前对于间充质基质细胞的表面标志物尚无确定结论，大部分关于表型特征的描述是通过体外细胞培养的方法来获得的。利用流式细胞仪的研究显示，体外扩增的基质细胞的表面标志物具有非特异性，表达CD105,CD73,CD90,CD166,CD44和CD29[11]。而体外扩增的骨髓基质细胞则不表达造血细胞系和内皮细胞系的标志物CD14、CD31、CD34和CD45。与骨髓相同，外周血来源的单个核系统中也包含间质系与造血系两大系统，其多向分化能力来源于间质系统的基质细胞，可在定向诱导条件下多向分化。PBSCs与BMSCs在表征上有许多共同点，Zvaifler等[2]从正常成年人外周血中成功分离出贴壁生长的外周血基质细胞，它们同样不表达 CD45、CD14和 CD34，表达 CD105、vimentin、collagen I、BMP-RIA 和 BMP-RII。本实验利用免疫细胞化学染色方法检测CD34和CD105，结果显示分离培养的细胞表达CD105，不表达CD34，证明该细胞属间质系，同时随着细胞的传代，细胞进一步得以纯化。

本文之所以使用“基质细胞(stromal cells)”，而没有使用“间充质干细胞(mesenchymal stem cell)”，是由于并没有进行单个细胞克隆基础上的严格鉴定。而间充质干细胞是一个严格的概念，需要对细胞长期的自我更新能力和发育潜能进行严格鉴定。国际细胞治疗协会给出了多潜能间充质基质细胞的定义[13]：经过一定技术手段纯化和富集的含有间充质干细胞的混合贴壁细胞。并提出了多潜能间质细胞鉴定的最低标准[14]：(1)多潜能间充质基质细胞一定是标准培养条件下的贴壁细胞；(2)表达 CD105、CD73和 CD90，低表达或不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR；(3)在体外标准诱导条件下可分化成至少三种不同类型的细胞：成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞。如果没有按照上述标准严格鉴定，应称为“基质细胞”[14]。因此本实验分离培养的细胞称之为“外周血基质细胞”。

茜素红染色常被用来鉴定细胞的成骨能力，其原理是茜素红染料可以与钙离子结合形成深红色的螯合物；OPN是重要的矿化组织非胶原基质蛋白，是成骨细胞分化的标志，在成骨细胞分化早期开始表达，矿化启动后大量合成。油红O染色的原理是使用油红O的油溶性，对其它的细胞结构着色性差。

本实验培养的PBSCs在体外经成骨诱导后使钙离子能够以钙盐的方式沉积下来，即钙结节，茜素红染色阳性；免疫细胞化学染色法对骨桥蛋白进行检测，结果显示，骨桥蛋白明显表达。经成脂诱导后，细胞胞浆中有油滴形成，油红O染色阳性。证明PBSCs具有向成骨、成脂方向分化的能力。

综上所述，我们的实验进一步证实从外周血中可分离培养出基质细胞，它们具有与骨髓基质细胞相似的特性与分化能力，能向成骨细胞和成脂细胞分化，有望成为细胞治疗或组织工程的种子细胞来源。

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