亚临床动脉粥样硬化患者血液环氧合酶-2水平研究

刘旭华，朱明慧，郭 凯

（郑州人民医院，河南郑州 450003）

亚临床动脉粥样硬化患者血液环氧合酶-2水平研究

刘旭华，朱明慧，郭 凯

（郑州人民医院，河南郑州 450003）

目的：探讨亚临床动脉粥样硬化（AS）患者血浆中环氧合酶Ⅱ（COX-2）的活性和单个核细胞COX-2mRNA的表达水平。方法：分别应用酶联免疫法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测100例亚临床AS患者和40例健康对照血浆COX-2活性与单个核细胞COX-2mRNA表达，并结合临床资料进行分析。结果：亚临床AS组COX-2血浆活性水平[(10.84±3.11)U/L]明显高于正常对照组[(6.97±1.25)U/L]，差异有统计学意义(P<0.05)；RT-PCR半定量分析发现亚临床AS组血液中单个核细胞COX-2mRNA表达的平均吸光度（0.244 8±0.090 3）较正常对照组（0.005 8±0.002 7）显著升高(P<0.01)。结论：COX-2血浆活性水平和COX-2mRNA的表达水平与亚临床AS有明显相关性，检测血浆COX-2活性和COX-2mRNA的表达可作为亚临床AS监测的参考指标。

动脉粥样硬化；环氧合酶Ⅱ；亚临床

亚临床动脉粥样硬化（AS）是指有AS的易患因素,而无AS临床表现的疾病发展阶段。资料显示[1]：该阶段动脉内存在活跃的低度慢性炎症，动脉内的轻微炎症是一个引发刺激、损伤、愈合的反复过程，最终形成斑块，其结果导致动脉狭窄或粥样斑块。环氧合酶Ⅱ(COX-2)是动脉粥样硬化过程中重要的炎症介质之一。RT-PCR分析表明COX-2在血管平滑肌、单核细胞、成纤维细胞均有表达，COX-2的过度表达可造成血管壁的炎症、斑块的不稳定和内膜增生。许多病理研究表明，COX-2直接参与了AS病理发生及斑快炎性反应的调控过程。笔者采用外周血测定COX-2水平和COX-2mRNA的表达，方便简捷,能为临床诊治提供参考。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 亚临床AS组 选取100例患者，其中，男62例，女38例，年龄27～82岁，平均（54.0±12.8）岁。其均为有高血压、高血脂、长期抽烟史、糖尿病或肥胖等至少一项以上AS的易患因素但无症状的亚临床AS疾病患者，或有酗酒史、心理或社会压力大者，且超声检测颈动脉 IMT>1.0 mm或发现斑块且无心脑肾及外周血管病变的临床表现[2]。

1.1.2 健康对照组 正常对照组来自体检健康人群，共40例，其中，男 25 例，女 15 例，年龄 32～81 岁，平均（54.5±12.3）岁，无高血压、糖尿病及心、肺、肝、肾、脑和血液系统的疾病，无近期外伤手术史。全部入选对象均排除有急慢性感染、肿瘤、免疫性及变态反应性疾病。

1.1.3 标本采集 收集静脉血5 ml EDTA抗凝，3 000 r/min离心5 min，分离血浆；淋巴细胞分离液1 500 r/min离心15 min分离单个核细胞。分别于-70℃冻存备用。

1.2 仪器与试剂

COX-2活性试剂盒由西班牙Cayma公司提供。ELX 800NB酶标仪由美国BIO-TEK公司生产。核酸分析仪DU800由美国贝克曼公司生产，核酸扩增仪PE9700由美国ABI公司生产，Trizol试剂由美国Invitrogen公司生产，淋巴细胞分离液由中国医学科学院生物工程研究所生产，Oligo(dt)20引物及逆转录酶均为美国Promega公司产品，GELDOC-OTTS凝胶分析系统由美国UVP公司生产。

1.3 检测方法

1.3.1 血浆活性检测 酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测COX-2的活性。试剂盒平衡至室温，所有标本复溶后严格按试剂盒说明书在规定时间完成操作，试验终止后酶标仪于590 nm处测得所有标本吸光度，根据试剂盒提供公式转换成COX-2活性。

1.3.2 逆转录PCR检测单个核细胞中COX-2mRNA表达Trizol试剂抽提提取单个核细胞总RNA，用核酸分析仪DU800检测RNA浓度和纯度。取2 μg总RNA，加入Oligo(dt)20引物及逆转录酶在25 μl体积下，行以下热处理：30℃，10 min；42℃，20 min；99℃，5 min；4℃，5 min；最后瞬间离心。完成逆转录反应后，进行聚合酶链反应。COX-2引物序列为:上游 5′-TGAAACCCACTCCAAACACA-3′，下游 5′-TGGAACAACTGCTCATCACC-3；β-actin 引物序列为：上游 5′-CGT GACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下 游 5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′，均由上海生物工程公司合成。反应条件 COX-2 为：94℃，30 s；55℃，1 min；72℃，2 min；72℃，10 min，35 个循环；β-actin 为：94℃，1 min；56℃，1 min；72℃，1 min；72℃，7 min，35个循环。COX-2、β-actin的扩增产物分别为728 bp和375 bp。经2%琼脂糖凝胶电泳，利用GELDOC-OTTS系统对扩增产物条带进行扫描，以COX-2/β-actin的吸光度(A值)作为COX-2mRNA表达的相对含量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 血浆COX-2活性和血液中单个核细胞COX-2mRNA表达

见表1。

表1 COX-2在亚临床AS组与对照组中比较(±s)

表1 COX-2在亚临床AS组与对照组中比较(±s)

与正常对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

组别 例数（n） COX-2(U/L) COX-2mRNA(A值)亚临床AS组正常对照组100 40 10.84±3.11*6.97±1.25 0.244 8±0.090 3**0.005 8±0.002 7

2.2 血浆COX-2活性和血液中单个核细胞COX-2mRNA表达相关性分析

直线相关分析发现血浆COX-2活性和血液中单个核细胞COX-2mRNA 表达之间呈正相关（r=0.791，P<0.05）。

3 讨论

COX-2具有“炎症应答基因”的特点，能引起炎症部位的PGI2、PGE2和PGE1等的含量增加，促进炎症反应，加重组织损伤。而COX-2诱导和表达增加又引起炎症反应的放大和增强:COX-2可诱导血管生长因子合成，使新生血管增多而促进了粥样斑块病变的发生和发展[3]。Belton等[4]对42名进行外科血管重建手术的AS患者进行研究，通过免疫组化及RT-PCR方法，发现COX-2在AS区域表达。不仅如此，涉及AS形成过程的促炎症反应介质，包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1、干扰素(IFN)-α等炎症因子、缺氧以及切应力刺激等，均可诱导COX-2表达[5]。文献有关血浆COX-2活性检测和血液中单个核细胞COX-2mRNA表达水平的研究报道并不多，本研究发现：在亚临床AS阶段，血液中即可检测到低水平的COX-2表达。

亚临床冠状动脉粥样硬化是指有动脉粥样硬化的易患因素如年龄、性别、吸烟、肥胖、高血压、高血脂、糖尿病以及胰岛素抵抗等，而无冠状动脉粥样硬化的临床表现。动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病的病理基础，除了传统易患因素，近年一些非传统易患因素越来越引起人们的重视，如Hcy、炎症、hs-CRP、氧化修饰脂蛋白等。已有证据表明[6]：COX作为前列腺素(PG)合成过程中的一个限速酶，在炎性反应中起重要的调控作用。当COX-2大量被诱导生成和表达时，炎性反应被放大和增强。COX-2还可诱导血管生长因子合成，使新生血管增多，促进粥样斑块病变的发生和发展[7]。因此降低细胞中COX-2表达是治疗动脉粥样硬化的一个关键环节。选择性COX-2抑制剂可以抑制血管炎症，因而可以减少单核细胞浸润，延缓AS进程，增加斑块稳定性从而减少粥样硬化血栓事件[8]。

表1显示亚临床AS组血浆COX-2活性显著高于对照组，血液中单个核细胞COX-2mRNA表达亚临床AS组非常显著高于对照组。说明在亚临床AS阶段，局部炎症部位有COX-2表达增高而释放入血。两种方法之间显著相关（r=0.791，P<0.05）。相对于 COX-2mRNA 检测，血浆中 COX-2检测较为简单，不需要特殊设备，可方便应用于高危人群监测，以便临床进行早期干预，从而可能有助于降低心血管意外发作风险[9]。

[1]Keichl S,Egger G,Mayr M,et al.Chronic infections and the risk of carotid atherosclerosis:Prospective results from a large population study[J].Circulation,2001,103:1064-1071.

[2]Riley WA.Cardioyascular risk assessment in individual patients from carotid intimal-medical thickness measurements[J].Curr Atheroscler Rep,2004,6(3):225-231.

[3]LintonMF,Fazio S.Cyclooxygenase-2 and inflammation in atherosclerosis[J].CurrOpin Pharmaco,2004,4:116-123.

[4]Belton O,Byrne D,Kearney D,et al.Cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2-dependentprostacyclin formation in patients with atherosclerosis[J].Circulation,2000,102(8):840-845.

[5]Massy ZA,Swan SK.Cyclooxygenase-2 and atherosclerosis:friend or foe[J].Nephrol Dial Transplant,2001,16(12):2286-2289.

[6]Cipollone F,Rocca B,Patrono C.Cyclooxygenase-2 expression and inhibi tion in atherothrombosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Bio,2004,24(2):246-255.

[7]Mac Rac F,Sergio F.Cyclooxygenase-2 and atherosclerosis[J].CurrOpin Lipido,2002,13(5):497-504.

[8]PittB,Pepine C,Willerson JT.Cyclooxygenase-2 inhibition and cardiovascular events[J].Circulation,2002,106(2):167-169.

[9]Grosser T,Fries S,Fitzgerald GA.J Biological basis for The cardiovascular conseguences of COX-2 inhibition:Therapeutic challenges and opportunities[J].Clin Invest,2006,116(1):4-5.

R115

B

1674-4721（2010）09（b）-074-02

2010-08-09）