清肺消炎丸对COPD急性发作期大鼠作用机制的研究

刘 伟 孙增涛 刘恩顺 付 敏 关 鹏 苏景深天津中医药大学第二附属医院（300161）

清肺消炎丸对COPD急性发作期大鼠作用机制的研究

刘 伟 孙增涛 刘恩顺 付 敏 关 鹏 苏景深
天津中医药大学第二附属医院（300161）

消肺消炎丸；COPD；实验研究

COPD是以慢性炎症以及炎症性损伤和修复造成气道和血管壁重塑为基本病理特征，进而引起慢性气流受限或受阻的一类疾病。CO P D目前居全球死亡原因的第4位。[1]我国40岁以上人群COPD的总患病率达8.2%，其中男性的患病率是1 2.4%，女性是5.1%，COPD在农村的患病率是8.8%，在城市是7.8%[2]。清肺消炎丸是在医圣张仲景《伤寒论》“麻杏石甘汤”基础上化裁，组成的中药复方制剂，经多年临床观察，该药清肺化痰、止咳平喘功效独特，临床应用疗效显著，可以满足COPD急性发作期临床治疗需要并得到临床试验的验证。本研究从COPD大鼠肺组织病理、气道和肺部炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等指标的变化，探讨清肺消炎丸治疗COPD急性发作期的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性清洁级Wistar大鼠40只，月龄8～10周，平均体重250g～300g，由天津中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 药物 清肺消炎丸，由天津达仁堂制药有限责任公司提供；氨茶碱片，天津力生制药股份有限公司，批号：0801002，规格0.1g/片，研碎溶于生理盐水制成悬浊液。

1.1.3 试剂 大鼠ELISA 法GSH试剂盒、SOD试剂盒（美国Adlitteram diagnosticlaboratories lnc公司生产）；MMP-9及山羊二步法检测试剂盒(pv6003)试剂盒：购于北京中杉生物技术有限公司。MMP-2试剂盒、TIMP-1试剂盒、Ln试剂盒、TNF-α试剂盒、TGF-β1试剂盒：购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.4 仪器与设备 OLYMPUS CX—31显微镜为日本OLYMPUS光学仪器有限公司生产。JVC数码相机为日本JVC公司生产。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统由武汉千屏影像技术有限责任公司生产。自制烟雾染毒箱（长宽高：60cm×39cm×40cm）；

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法 按照随机数字表法分为四组，每组10只。空白对照组(A组)，COPD模型组(B组)，氨茶碱组(C组)，清肺消炎丸组（D组）。采用烟熏及内窥镜下气管滴入内毒素造模法制造 COPD 大鼠模型[1]。除正常对照组呼吸正常空气外，其它各组大鼠每天上午在自制的密闭箱内熏大前门牌香烟雾0.5h。在实验开始第 1 天和第 14 天时，各组大鼠均用乙醚麻醉，除正常对照组在硬式鼻腔镜引导下经声门缓慢滴入200μl 生理盐水外，其它各组大鼠均经上方式气道内缓慢注入200μl 内毒素水溶液(1mg/ml)，当日不予被动吸烟。连续熏烟四周后，造成慢性阻塞性肺疾病模型。

1.2.2 给药方法:造模成功后，各组分别给药干预 动物给药剂量参照动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表。清肺消炎丸组药物用量为：1.56g/ kg；氨茶碱组药物用量为：31.25mg/kg；模型组和对照组分别灌服 0.9%生理盐水；各实验组给药体积均为 1ml/100g 体重，每天给药一次，连续给药 7天。

1.2.3 观察指标及方法 各组大鼠在最后一次灌药后，隔天取材，以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉麻醉大鼠，腹主动脉取血5ml，离心取上清液，采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定大鼠血清中SOD、GSH，免疫组化方法M检测MP-2，MMP-9，TIMP-1，LN，TGF-β。统一切取各组大鼠右肺并浸泡于中性福尔马林液固定保存，固定48h 后，取固定好的右肺组织常规脱水、透明、浸腊、包埋，切成5μm 厚的切片，行苏木精-伊红(HE) 染色，观察一般病理情况，

1.2.4 统计学方法 实验数据采用SPSS11.5统计软件分析，所有结果均以表示。各计量数据先进行正态检验和方差齐性检验，凡符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多组间两两比较采用LSD法。对等级数据和不符合正态分布或方差齐性的计量数据，则进行秩和检验(Kruskal-Wallis法)，多组间两两比较采用Mann-Whitney U法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 正常组大鼠体肥，反映敏捷，好活动，皮毛有光泽。造模各组大鼠神情倦怠，喜蜷缩，皮毛无光泽且活动能力下降。造模各组大鼠于第三天的时候开始有咳嗽，口鼻潮湿等。在造模过程中，大鼠出现咳嗽，呼吸困难、喉间哮鸣音，喜静少动，强刺激活动后可见上述喘咳症状加重。喂药后，清肺消炎丸组可见气喘、咳嗽减轻，以及口鼻分泌物减少。氨茶碱组亦可见喘咳症状减轻。

2.2 肺组织病理学观察 正常对照组（图4）呼吸道及肺泡结构正常，支气管纤毛排列整齐，肺泡结构完整，无气肿及少许炎症。COPD 模型组（图1）可见肺泡腔明显扩大、间隔变窄、肺泡壁断裂、扩张的肺泡融合成较大的囊腔，呈明显的肺气肿改变；血管腔充血，肺间质及气道管壁炎性细胞浸润；肺间质及血管旁均可见大量吞噬了烟尘颗粒的AM，部分AM崩解破坏；成纤维细胞明显增加，可见小气道平滑肌增殖、管腔狭窄以及血管壁增厚等结构重塑。氨茶碱组（图3）仍见有大量炎症细胞的浸润；清肺消炎丸组（图4）用药后可见明肺部炎症较模型组有明显的改善。

图1

图2

图3

图4

2.3 大鼠肺组织肿瘤坏死因子α（TNF-α） 见附表1

表1 大鼠肺组织TNF-α阳性细胞的平均吸光度值

2.4 大鼠肺组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的检测结果 见附表2

表2 大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1阳性细胞的平均吸光度值

2.6 大鼠肺组织基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和粘连蛋白（LN）蛋白的检测结果 见表3。表3 大鼠肺组织MMP-2和LN阳性细胞的平均吸光度值

注：与空白组比* P＜0.05；与模型组比，△P＜0.05；

3 讨论

COPD 是一种以中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞(尤其是CD+8 T淋巴细胞) 在肺不同部位增加为特征的慢性炎症性疾病。激活的炎症细胞释放多种递质，包括TNF –α、IL – 8、白三烯B4 (LTB4 )等。这种异常的炎症反应是COPD重要病理过程如细支气管炎、肺气肿的危险因素。炎前因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 在COPD 气道慢性炎症的发生和发展中的重要地位已获得公认。它能诱导炎症反应，增加气道中性粒细胞数目，促进中性粒细胞粘附而加强异常细胞外弹性蛋白溶解活性，在COPD发生发展中起重要作用。

COPD 大鼠肺组织中TNF-α水平明显高于正常对照组(P＜0.05)，提示该细胞因子与COPD 气道炎症及其病理改变密切相关。清肺消炎丸可降低肺组织中TNF-α水平，表明该药具有一定的抑制COPD 气道及肺部炎症的作用。可以认为清肺消炎丸通过减少肺组织中TNF-α水平，进而减轻炎症细胞的浸润，是治疗该病的有效途径之一。

MMP-9和TIMP-1 的动态平衡，目前被认为是反映气道组织破坏与修复动态平衡的标志。MMP-9即明胶酶B，其主要作用为降解弹力纤维、明胶、及Ⅳ、V型胶原。其参与COPD的发病机制主要是通过破坏肺泡基质成分，使肺泡结构破坏，形成肺气肿及参与气道重塑而导致气流阻塞。MMP-2即明胶酶A主要降解弹力纤维、纤维连接素及I、Ⅳ、V、Ⅶ 型胶原等，MMP-2的增多使气道结构细胞失去正常的支撑作用。LN是基底膜透明层特异的结合蛋白，是细胞外基质（ECM）的主要组成部分之一，其作用是固定上皮、内皮和肌肉并支持其生长。LN 显著增高，表明有过多的LN生成并沉积于肺组织，同时释放入血和支气管上皮衬液，参与上皮和内皮细胞的修复和过度增生。细胞外基质破坏和修复常常维持平衡，一旦平衡打破即出现病理状态。

本实验本研究结果表明，COPD 大鼠模型肺组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1及LN的水平明显高于正常对照组(阳性细胞平均值P＜0.05)，提示蛋白酶/抗蛋白酶系统及细胞外基质参与了COPD病理改变。

清肺消炎丸组可降低肺组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1及LN水平，改善MMP-9/TIMP-1比例失衡，表明该药具有调节蛋白酶/抗蛋白酶，抑制细胞外基质过度沉积，改善气道重塑的作用。

[1] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.COPD诊治指南(2007年修订版)[S].继续医学教育,2007,21(2):31-42.

[2] ZHONG N，WANG C，RAN P，et a1.Prevalence ofchronic obstructive pulmonary disease in China：a large，population— based survey[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176:753-760

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.122

1672-2779（2010）-18-0159-02

2010-07-30）