复元醒脑汤对高血压性脑出血大鼠脑组织形态学改变影响实验研究※

方邦江 周 爽 陈宝瑾 黄金阳 耿 赟 季学清 郭 全 王宏 上海中医药大学附属龙华医院（0003） 第二军医大学（00433）

复元醒脑汤对高血压性脑出血大鼠脑组织形态学改变影响实验研究※

方邦江1周 爽2陈宝瑾1黄金阳1耿 赟1季学清1郭 全1王宏1
1 上海中医药大学附属龙华医院（200032） 2 第二军医大学（200433）

目的 探讨复元醒脑汤对高血压性脑出血大鼠脑组织形态学改变的干预作用。方法 将SHR大鼠随机分为四组，分别为假手术组(n =20)、模型组(n=20)、安宫牛黄胶囊组(N=20)、复元醒脑汤组(N=20)，并与WKY假手术组((n =20)对照。模型组、安宫牛黄胶囊组和复元醒脑汤组在收缩压达到21.3KPa基础上以胶原酶加肝素尾状核注射法诱发脑出血，建立高血压性脑出血模型，其中安宫牛黄胶囊组和复元醒脑汤组分别给予相应药物干预，于造模后连续灌胃3天。两假手术组脑内注射及灌胃均为生理盐水，模型组灌胃为生理盐水。观测各组动物神经缺损行为体征、脑组织含水量及病理形态学改变。结果 SHR模型组与WKY假手术组、SHR假手术组比较，神经缺损行为体征评分升高（均P＜0.01），脑组织含水量增加（均P＜0.01），出现病理形态学改变；SHR复元醒脑汤和SHR安宫牛黄胶囊两治疗组与SHR模型组比较，神经缺损行为体征评分降低（均P＜0.01），脑组织含水量减少（均P＜0.01），病理形态学改变明显改善；上述指标变化复元醒脑汤组与安宫牛黄胶囊组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 复元醒脑汤可改善高血压性脑出血大鼠脑组织病理形态学改变，减轻脑水肿程度，改善神经功能缺损，达到治疗高血压性脑出血的目的。

脑出血；脑水肿；自发性高血压大鼠

1 材料与方法

1.1 实验动物 SHR大鼠80只，雄性，体重320±20g，SPF级；京都Wista（Wistar Kyoto，WKY）大鼠20只，雄性，体重320±20g，SPF级。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证：SCXK(沪)2007-005，饲养于上海中医药大学附属龙华医院科技楼实验动物中心。

1.2 主要试剂和仪器 胶原酶Ⅶ、Sigma-Aldrich Inc(USA)；肝素、常州千红生化制药股份有限公司；RBP-1型大鼠尾压心率测定仪、北京中日友好医院临床医学研究所；ZH-蓝星B型脑立体定位仪、淮北正华生物仪器设备有限公司；微量进样器、上海安亭微量进样器厂；FA2004B电子天平、上海精密科学仪器有限公司；恒宇电热恒温鼓风干燥箱C01-1-BS、上海跃进医疗器械厂；电热恒温水箱（HH-W21-420）、上海跃进医疗器械厂；LEICA CM1900冰冻切片机、LEICA Inc（GER）；LEICA TP1020自动脱水机、LEICA Inc（GER）；LEICA EG1160自动包埋机、LEICA Inc（GER）。

1.3 实验药物 复元醒脑汤（人参9g单煎、三七15g，胆南星15g，大黄9g后下等），由本院制剂室生产提供，浓度为1200g生药／L；安宫牛黄胶囊由河北安国药业集团有限公司生产，0.4g/粒，批号：066401。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 购得动物后，适应性喂养1周，运用大鼠心率血压计测定大鼠尾动脉收缩压，SHR大鼠血压达到21.3KPa以上后，统一称重，按林氏[1]方法应用SPSS11.5软件包将SHR大鼠随机分为SHR假手术组（SHRS，N=20）、SHR模型组(SHRM，N=20)、SHR安宫牛黄胶囊组（SHRTa，N=20）、SHR复元醒脑汤组（SHRTf，N=20）；WKY大鼠为假手术对照组（WKYS，N=20）。

1.4.2 脑出血模型建立 以任氏[2]胶原酶加肝素联合尾状核注射诱导的方法建立脑出血动物模型。造模前1日，各组大鼠禁食。大鼠经10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔麻醉。头顶备皮后俯卧位固定于ZH-蓝星B型脑立体定位仪上，正中矢状切开头皮，剥离骨膜，调节门齿托的高度，使动物的前、后囟处于同一水平。头皮下正中切口约0.8cm，于颅骨背侧前囟后0.2mm、中线旁2.9mm处钻孔，用固定于立体定位仪上的微量进样器沿钻孔进针，深约6mm (此处为尾状核位置)，注射含有0.5U/μl胶原酶Ⅶ和7U/μl肝素的生理盐水1μl，缓慢退针，钻孔处填入明胶海绵，缝合皮肤。WKY假手术组与SHR假手术组除注入尾壳核的液体为生理盐水外，其余步骤同模型组。

1.4.3 药物干预 SHR复元醒脑汤组于造模成功后，每日按生药4.22g/kg体重/d给予复元醒脑汤灌胃，每日1次，连续3天；SHR安宫牛黄胶囊对照组于造模成功后，每日按169mg/kg体重/d给予安宫牛黄胶囊灌胃，每日1次，连续3天。WKY假手术组、SHR假手术组、SHR模型组于造模成功后每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3天。

1.5 检测项目与方法

1.5.1 血压测定 大鼠适应性喂养1周后，运用RBP-1型大鼠心率血压计，在大鼠清醒状态下经尾动脉测定收缩压，每只大鼠测3次，取平均值。

1.5.2 神经缺损行为体征观察 造模后3天，各组大鼠采用Bederson[3]神经体缺损行为体征评分法进行评分。

轻抓鼠尾，提起高于地面1m，正常大鼠前爪伸直。

0 级（0 分）：无神经功能缺损

I级（1 分）：血肿对侧前肢回收屈曲于腹下，同侧前肢向地面伸展

II级（2 分）：I级体征+俯卧于桌面时从血肿侧向对侧推大鼠时阻力降低

III级（3 分）：I级体征+II级体征+大鼠行走时向血肿对侧肢体旋转(呈追尾状)

1.5.3 脑组织含水量测定 脑组织含水量(Brain Water Content,BWC)采用干湿脑重法测定。造模后3天，每组各取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，迅速开颅取脑，取血肿周围脑组织（WKY假手术组和SHR假手术组取相应部位脑组织），电子天平先称取湿重，放入电热恒温鼓风干燥箱100℃烘烤24h，再称取干重，计算脑组织含水量：

1.5.4 脑组织病理学观察 造模后3天，每组各取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏，灌注针头从左心室插至主动脉根部，在右心耳处剪开作为出口，迅速灌注生理盐水总量约200ml，至右心耳流出液体无血色后，灌注4%多聚甲醛，至大鼠四肢变硬，口唇、内脏变白，迅速开颅取脑。取病灶侧（SHR假手术组和WKY假手术组取相应部位）脑组织置于10%中性甲醛溶液中固定，经梯度酒精序列脱水、浸蜡、石蜡包埋，切5μm片，苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色，光学显微镜下观察皮层组织形态学改变。

1.6 统计分析 应用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用方差分析；等级资料采用Ridit分析[4]。检验效能以P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为差异具有非常显著性。

2 结果

2.1 神经缺损行为体征评分 由表1可见各组大鼠神经缺损行为体征评分情况：SHR假手术组与WKY假手术组比较差异无显著意义（P＞0.05）；SHR模型组、SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与WKY假手术组、SHR假手术组比较均具有非常显著差异（P＜0.01）。SHR安宫牛黄胶囊组、SHR复元醒脑汤组与SHR模型组比较均具有显著差异（P＜0.01）；SHR安宫牛黄胶囊组与SHR复元醒脑汤组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠神经缺损行为体征评分

2.2 脑组织含水量 由表2可见，各组大鼠脑组织含水量情况：SHR假手术组与WKY假手术组比较差异不具有统计学意义（P＞0.05）；SHR模型组、SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与WKY假手术组、SHR假手术组比较具有非常显著差异（P＜0.01）；SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与SHR模型组比较均具有非常显著差异（P＜0.01）；SHR复元醒脑汤组与SHR安宫牛黄胶囊组比较无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠脑组织含水量 (X±s)

2.3 脑组织病理形态学改变

WKY假手术组大鼠大脑皮层神经细胞排列紧密，胞浆淡染，核仁清楚；SHR假手术组大鼠大脑皮层神经细胞形态及数目与WKY假手术组基本相同，可见部分血管壁增厚；SHR模型组大鼠大脑皮层神经细胞数量明显减少，细胞肿胀严重、排列紊乱，大量神经细胞变性，结构不清，血管内皮细胞肿胀，管腔内血细胞聚集嵌塞微血管，细胞间隙空化明显；SHR复元醒脑汤治疗组大鼠和SHR安宫牛黄胶囊组大鼠大脑皮层神经细胞肿胀程度减轻，微血管内皮细胞的损伤显著减轻，胶质细胞增多。（见附图）

3 讨论

脑出血，属中医“中风”的范畴。中医学有关中风的记载，始见于《内经》。唐宋以前，诸家皆从内虚邪中之说；金元以降，火、虚、痰等论始发其端；及至明清，内伤积损、气虚血瘀、肝阳化风、血气上逆等说愈发丰富。其病因多认为与风、火、痰、虚、瘀密切相关。我们在长期临床过程中发现，中风大多为中老年人，正气亏虚为中风的基础。《杂病源流犀烛·中风源流》云：“人至五六十岁，气血就衰，乃有中风之病”。《景岳全书·非风》云：“卒倒多由昏愦，本皆内伤积损颓败而然”。气虚则痰瘀内生，痰、瘀分别是津、血的病理产物，一旦生成，又成为新的病理过程启动之因。痰是水液代谢障碍形成的病理产物，痰的生成同脾肾功能密切相关。肾者主水，肾气不足则水液蒸腾气化无力，聚而为痰；脾主运化，脾不健运则水湿不化，痰浊内生。“气为血之帅”，气虚无力推动血液运行而为瘀血。痰、瘀又可相互促生，胶着为患。痰瘀内阻，郁而化热，热极生风；或阴血亏虚，水不涵木，肝阳化风，风火相煽，发为中风。针对中风“正气亏虚、痰瘀互结、风火相煽”病机，采取复元醒脑为主，佐以逐瘀化痰、泄热息风等促进醒脑开窍之法，自拟复元醒脑汤治疗脑出血取得良好临床疗效。本方人参、三七、大黄、胆南星等药共用。人参大补元气，补脾益肺，脾气健运，肺气宣畅，则痰浊自消，气为血帅，气盛血行，瘀血自消，可达扶正祛邪之目的，为治本之药；三七止血不留瘀，针对出血性中风止血，并且可以达到化瘀目的；大黄通腑泻下，清热解毒，兼具活血化瘀之功，与三七合用一通一涩，止血不留瘀；胆南星清热化痰，息风定惊。诸药合用，方小力专，起“复元醒脑、逐瘀化痰、泄热熄风”之功。

既往对于中医药对脑出血干预作用的实验研究表明[5,6]，中药对脑出血大鼠神经功能有较好的改善作用，同时能明显降低大鼠脑水肿程度。本实验结果证实模型组大鼠神经缺损行为显著恶化，脑组织含水量显著增加，表明脑出血后脑水肿在病情进行性加重过程中发挥重要作用，脑水肿程度越重病情越凶险。安宫牛黄丸为临床治疗脑出血急性期常用中成药，相关研究表明安宫牛黄丸可以显著减轻脑出血后脑水肿程度及神经缺损行为[7,8]。复元醒脑汤可以减轻皮层神经细胞肿胀程度，炎性细胞浸润和微血管内皮细胞的损伤亦显著减轻，降低高血压性脑出血大鼠脑组织含水量，进而改善神经缺损行为，并且其对脑水肿程度及神经缺损行为改善具有和安宫牛黄胶囊等同的效果。

附图 各组大鼠病理形态学改变

图1 WKYS(×200)

图2 SHRS(×200)

图3 SHRM(×200)

图2 SHRS(×200)

图4 SHRTa(×200)

图5 SHRTf(×200)

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The Experimental Study of Fuyuan Xingnao Decoction on Blood-brain Barrier Permeability in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Rats

LIN Mei1FANG Bang-Jiang2ZHOU Shuang3CHEN Bao-Jin2HUANG Jin-Yang2GENG Yun2JI Xue-Qing2GUO Quan2WANG Hong2
Department of Chinese Medicine,Central Hospital of Xuhui District,Shanghai,China Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Second Military Medical University

Objective To study the effect of Fuyuan Xingnao Decoction on pathomorphology change in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Rats brain tissue.Methods Spontaneously Hypertensive Rats were randomly divided into four groups,sham operation group(SHRS,N=20),model group(SHRM,N=20),Angong Niuhuang capsule group(SHRTa,N=20),and Fuyuan Xingnao Decoction group(SHRTf,N=20),compared with Wistar Kyoto rats sham operation group(WKYS,N=20).After the systolic pressure stabilizing in 21.3KPa,SHRM,SHRTa and SHRTf were induced cerebral hemorrhage by caudate nucleus injection with collagenase and heparin.Then SHRTa and SHRTf were given corresponding drugs in intragastric administration for three days after getting into cerebral hemorrhage,while SHRS and WKYS were all given intracerebral injection and intragastric administration with physiological saline,and SHRM was given intragastric administration with physiological saline.Rats of all groups were observed respectively their behavior and physical signs of neurologic defect,brain tissue moisture capacity and pathomorphology change.Results Compared with WKYS group and SHRS group,the SHRM group behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity increased up（P＜0.01），presented pathomorphology change in brain tissue；SHRTa group and SHRTf group compared to SHRM group,behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity lowered（P＜0.01）,and pathomorphology change in brain tissue obviously improved；there is no statistical significant difference between SHRTa group and SHRTf group on the index changes（P＞0.05）.Conclusion Fuyuan Xingnao Decoction may achieve the purpose of treating hypertensive cerebral hemorrhage through improve pathomorphology change in brain tissue obviously,relieve cerebral edema,and improve neurologic impairment.

Cerebral Hemorrhage；Cerebral Edema；Spontaneously Hypertensive Rats

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.136

1672-2779（2010）-18-0182-03

脑出血（Cerebral Hemorrhage，CH）是指原发性脑实质的非创伤性出血，是临床常见的脑血管疾病，主要病因是高血压。高血压伴发脑内小动脉病变，当血压骤升时破裂出血，称为高血压性脑出血。脑出血后引起机体和脑组织局部发生系列病理生理学反应，在血肿周围脑组织形成水肿带，继而引起神经细胞及其轴突的变性和坏死。脑出血后脑水肿的预防和治疗为临床实践中重要一环，在降低患者死亡率和致残率、改善患者生活质量方面起重要作用。临床应用复元醒脑汤治疗脑出血取得显著临床效果，为了进一步探讨复元醒脑汤治疗脑出血的作用机理，本实验拟在建立高血压性脑出血大鼠模型基础上，观测复元醒脑汤对其神经功能缺损、脑组织含水量、脑组织病理形态学改变的干预作用。

上海市公共卫生新三年行动计划项目（No.G200720）

2010-07-30）