油菜蜂花粉黄酮醇苷的体内外抗氧化研究

孙丽萍，徐 响，廖 磊，刘魁英，杨佳林

油菜蜂花粉黄酮醇苷的体内外抗氧化研究

孙丽萍1，徐 响1，廖 磊2，刘魁英2，杨佳林1

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093； 2.北京市卫生局临床药学研究所，北京 100035)

以油菜蜂花粉黄酮醇苷组分为原料，以还原力和DPPH自由基清除率为指标研究黄酮醇苷在化学模拟体系中的抗氧化活性。结果表明，油菜蜂花粉黄酮醇苷的抗氧化活性不及其苷元成分。以CCl4制备小鼠脂质过氧化损伤模型，通过体内自由基发生体系进一步研究花粉黄酮醇苷的抗氧化作用，并对可能的作用机制进行探讨。结果显示：油菜蜂花粉黄酮醇苷组分能够显著地降低脂质过氧化小鼠肝匀浆和血清中MDA含量，提高小鼠SOD活性和总抗氧化能力(T-AOC)，对脂质过氧化损伤有很好的保护作用，原因可能是体内有关酶系可将黄酮醇苷水解使其游离出酚羟基而发挥作用。本研究进一步肯定了油菜蜂花粉黄酮醇苷对机体氧化损伤的保护作用。

油菜蜂花粉；黄酮醇苷；抗氧化活性；脂质过氧化

蜂花粉是蜜蜂采集的有花植物的雄性生殖细胞，其不仅含有许多营养成分，还含有许多与生命科学相关的药效成分，是传统的纯天然营养保健品。黄酮类化合物具有多方面的生理活性，能增强心脏收缩，减少心脏搏动数；有止咳祛痰、抗毛细血管脆性和异常透过性、抑制肿瘤细胞作用等[1]。在复杂的生物化学反应过程中，黄酮类化合物具有较强的抗氧化性，对羟自由基具有较好的清除作用[2]，因而能延缓人体衰老。现已证明蜂花粉具有较强的抗氧化活性[3-4]。本课题组前期研究表明，油菜蜂花粉对酒精性肝损伤有预防作用[5-6]，其有效组分中不乏黄酮类化合物。

本实验对油菜蜂花粉醇提物进行分离得到黄酮醇苷组分，采用化学模拟体系评价其DPPH自由基清除率和还原力，并进行脂质过氧化小鼠实验考察其体内抗氧化活性，探讨油菜蜂花粉黄酮醇苷对小鼠脂质过氧化损伤的影响，并对可能的作用机制进行探讨，为油菜蜂花粉中黄酮醇苷的抗氧化性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

清洁级ICR小鼠，70只，雌雄各半，体质量22～24g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2006-0009。

油菜蜂花粉(－20℃保藏) 甘肃天水；DPPH、山奈酚、槲皮素 美国Sigma公司；D101大孔树脂 南开大学化工厂；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(批号：20100311)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号：20100322)、超氧化物酶(SOD)测试盒(批号：20100324)南京建成生物工程公司；天然VE(250mg/粒，160粒/瓶批号：2009090665) 海南养生堂药业有限公司；甲醇(色谱纯) Fisher公司；其他所用试剂均为分析纯。

LC-20A高效液相色谱、UV-2550 型紫外-可见分光光度仪、UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.2 样品制备

取油菜蜂花粉，超临界二氧化碳破壁[7]后，加入10倍体积的体积分数80%的乙醇，在500Hz超声提取1h，4000r/min离心10min，取沉淀重复提取一次，合并上清，真空浓缩脱醇后，加入5倍体积的去离子水悬浮，振荡，4000r/min离心10min，沉淀重复一次，合并上清，进行D101柱层析(2.5cm×50cm)，用体积分数50%乙醇洗脱，收集洗脱组分，减压浓缩干燥，－20℃贮存备用。

1.3 HPLC分析[8]

Sham-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm)；流动相为甲醇-去离子水，其中去离子水含有体积分数0.1%的磷酸，甲醇体积分数为：0～15min，25%；15～35min，25%～75%；35～40min，75%～25%；40～45min，25%；流速：1.0mL/min；波长：370nm；温度：40℃。1.4化学模拟体系抗氧化实验

1.4.1 DPPH自由基清除率测定[9]

DPPH溶液在520nm波长处有特征吸收峰，加入提取液后，以吸光度下降百分率表示DPPH自由基的清除能力。取1mg/mL样品液2.0mL，加入0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2.0mL，充分混匀后，于暗处室温放置30min，测定520nm波长处的吸光度，同时，以80%的乙醇为空白，每个样品测定3次，求平均值。样品对DPPH自由基清除率按公式(1)计算。

式中：A空白为2.0mL 80%乙醇加入2.0mL 0.2mmol/L DPPH溶液；A样品为2.0mL样品液加2.0mL 0.2mmol/L DPPH溶液；A调零为2.0mL的80%乙醇加2.0mL样品液。

1.4.2 还原力的测定[9]

分别准确吸取样品液1.5mL，加入1.5mL pH6.6的磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L)和1.5mL质量分数1%的铁氰化钾溶液，混匀，50℃保温20min后冷却，加入1.5mL质量分数10%的三氯乙酸溶液，混合后以5000r/min离心l0min。取上清液2.5mL，加2.5mL去离子水和0.5mL质量分数0.1%的三氯化铁溶液，以体积分数80%乙醇调零，测定700nm波长处的吸光度，以VC作为标准对照物，将样品的吸光度换算成每毫克样品干质量含等量VC微克数表示。

1.5 脂质过氧化小鼠实验[10]

将70只小鼠随机分4组，分别为空白对照组、四氯化碳组(模型组)、阳性对照组、蜂花粉黄酮醇苷组。空白对照组和四氯化碳组分别灌胃给予生理盐水10mL/(kg bw·d)，VE组(阳性对照组)灌胃VE 1.0g/(kg bw·d)，样品组小鼠灌胃给予花粉黄酮醇苷95mg/(kg bw·d)，连续15d。末次给药后2h，空白对照组腹腔注射等体积橄榄油，其余各组均腹腔注射0.1% CCl4橄榄油溶液10mL/(kg bw·d)。禁食，自由饮水，16h后各组小鼠取血。以3500r/min离心10min，取血清，测定MDA含量和T-AOC、SOD活性；同时取适量肝组织用冰冷生理盐水冲洗，置冰浴中匀化，制得10%肝匀浆，以4000r/min离心10min，取上清液，测定MDA含量、T-AOC水平MDA含量用硫代巴比妥酸比色法测定，T-AOC水平和SOD活性用黄嘌呤氧化酶法测定，具体步骤均按各试剂盒说明书操作。

1.6 统计方法

使用SPSS11. 0统计软件包，所有数据用x±s表示，计量资料采用方差分析的One Way 检验，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有极显著性。

2 结果与分析

2.1 黄酮醇苷组分HPLC分析

油菜蜂花粉黄酮醇苷组分主要含有以山奈酚和槲皮素为苷元的黄酮醇苷化合物，其HPLC图谱分析见图1。

图1 黄酮醇苷组分HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of the flavonoid glycosides-rich rape pollen extract

由图1可知，15～25min的4个吸收峰经HCl酸解后完全消失，而出现了槲皮素和山奈酚的保留时间峰，说明保留时间在15～25min的4种物质是槲皮素和山奈酚的黄酮醇苷[11]。

2.2 体外抗氧化活性指标分析

体外抗氧化实验采用了化学模拟体系的还原力和DPPH自由基清除实验，结果见表1。

表1 还原力和DPPH自由基清除活性Table 1 Reducing power and DPPH free radical scavenging capacity of the flavonoid glycosides-rich rape pollen extract, kaempferol and quercetin

油菜蜂花粉黄酮醇苷组分DPPH半抑制质量浓度为119.438μg/mL，说明该组分具有一定的抗氧化活性，但山奈酚和槲皮素DPPH半抑制质量浓度分别为9.311μg/mL和5.809μg/mL，远低于黄酮醇苷组分，说明黄酮醇苷元的抗氧化活性强于黄酮醇苷组分。在两个苷元成分中，槲皮素的DPPH自由基清除能力更强。还原力实验显示出与DPPH自由基清除实验相同的结果，每1mg黄酮醇苷组分的还原力相当于43.876μgVC的还原力，而同剂量山奈酚相当于323.208μgVC，槲皮素相当于1032.642μgVC，说明在还原能力方面同样是槲皮素＞山奈酚＞黄酮醇苷，3个样品中只有槲皮素的还原能力强于VC。

2.3 体内抗氧化活性指标分析

本实验以脂质过氧化小鼠为模型，选用血清和肝匀浆中的MDA含量、T-AOC水平和SOD活性为指标考察花粉黄酮醇苷的抗氧化功效。与空白对照组比较，四氯化碳组小鼠肝组织中MDA含量显著升高(P＜0.01)，T-AOC水平显著降低(P＜0.01)；血清中的MDA水平也相应升高(P＜0.05)，说明脂质过氧化模型造模成功，结果见表2、3。

2.3.1 油菜蜂花粉黄酮醇苷对脂质过氧化小鼠肝脏指标的影响

测定脂质过氧化小鼠肝匀浆中MDA含量和T-AOC水平，结果见表2。

表2 油菜蜂花粉黄酮醇苷对脂质过氧化小鼠肝匀浆各指标的影响(x±s，n=10)Table 2 Effect of flavonoid glycosides derived from rape bee pollen on the levels of MDA and T-AOC in mouse liver homogenate (x±s,n=10)

由表2可见，油菜蜂花粉黄酮醇苷组能显著降低模型组小鼠肝组织中MDA的含量(P＜0.05)，能升高模型组小鼠肝组织中的T-AOC水平，与四氯化碳组比较具有显著性差异(P＜0.05)，说明油菜蜂花粉黄酮醇苷组能够减少小鼠肝组织细胞脂质过氧化的速度，抑制肝匀浆中MDA的生成，提高小鼠总抗氧化能力，提示油菜蜂花粉黄酮醇苷能明显对抗CCl4致肝线粒体脂质过氧化。

2.3.2 油菜蜂花粉黄酮醇苷对脂质过氧化小鼠血清各指标的影响

测定脂质过氧化小鼠血清中MDA含量和SOD活性、T-AOC水平，结果见表3。

表3 油菜蜂花粉黄酮醇苷对脂质过氧化小鼠血清抗氧化指标的影响(x±s，n=10)Table 3 Effect of flavonoid glycosides derived from rape bee pollen on the levels of MDA, SOD and T-AOC in mouse serum (x±s, n=10)

如表3所示，血清各项抗氧化指标中，与四氯化碳组对比，油菜蜂花粉黄酮醇苷组MDA含量降低，SOD活性、T-AOC显著地提高(P＜0.05)，表明油菜蜂花粉黄酮醇苷可增强机体清除自由基和抗氧化能力，对CCl4所致的脂质过氧化具有明显抑制作用。油菜蜂花粉黄酮醇苷组的实验剂量仅为VE组的1/10，但黄酮醇苷组增加SOD活性、T-AOC的效果好于VE。

3 讨 论

3.1 油菜蜂花粉黄酮醇苷对抗肝脂质过氧化的作用及机制

本实验研究显示，小鼠经CCl4致毒后，肝组织和血清中MDA含量较对照组显著增加，表明CCl4诱发脂质过氧化反应模型复制成功。黄酮醇苷预处理的小鼠在CCl4攻击下肝组织中MDA含量明显低于模型组(P＜0.05)，T-AOC水平明显高于模型组(P＜0.05)；同时，血清中MDA含量低于模型组，而SOD和T-AOC水平也明显高于模型组(P＜0.05)。说明油菜蜂花粉黄酮醇苷明显抑制实验小鼠肝组织和血清中MDA的异常升高，显著提高SOD活性和T-AOC，从而起到抗脂质过氧化的作用，其机制可能发生在多个环节：1)减少自由基、活性氧的生成；2)改善微循环；3)增加SOD活性；4)提高T-AOC；从而加速自由基、活性氧的清除。

3.2 黄酮醇苷体内外抗氧化差异产生的原因

研究表明，黄酮苷元清除人体氧自由基的生物活性明显优于黄酮糖苷，黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍。黄酮苷元的生物活性之所以大大优于黄酮糖苷，是因为黄酮类化合物在动物体内代谢时，仅有苷元型黄酮可以直接被吸收进入动物血液中，而大部分糖苷型的黄酮化合物在人体内不能通过小肠壁进入到血液中，而是被肠腔内微生物通过杂环裂解方式降解和代谢，其中仅有小部分黄酮在结肠内益生菌(如乳酸菌和双歧杆菌)分泌的水解酶作用下，产生苷元再重新吸收进入血液[12]。大肠中存在大量的厌氧菌产生α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、内-β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖碳苷酶等多种糖苷酶参与水解黄酮苷类化合物的各种糖苷键，能水解O-糖苷以及C-糖苷，肠菌水解生成的黄酮苷元一部分被大肠直接吸收，另外一部分被进一步裂解，产生小分子酚酸类成分被吸收入血液[13]。

因此，在非酶体系的DPPH自由基清除实验中黄酮醇苷的清除活性明显弱于其苷元的活性，而在脂质过氧化小鼠实验中黄酮醇苷具有很好的抗氧化活性，可能是由于体内有关酶系可将黄酮醇苷水解使其游离出酚羟基而发挥作用[14]。

4 结 论

本研究以花粉黄酮醇苷组分为原料，以还原力和DPPH自由基清除率为指标考察花粉黄酮醇苷在化学模拟体系中的抗氧化活性。结果表明，黄酮醇苷的抗氧化活性不及其苷元成分。以CCl4制备小鼠脂质过氧化损伤模型，通过体内自由基发生体系进一步研究了花粉黄酮醇苷的抗氧化作用，结果显示，花粉黄酮醇苷能够显著地降低脂质过氧化小鼠肝匀浆和血清中MDA含量，提高小鼠SOD活性和T-AOC，对脂质过氧化损伤有很好的保护作用，其原因可能是体内有关酶系可将黄酮醇苷水解使其游离出酚羟基而发挥作用。

[1]肖崇厚. 中药化学[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1987: 193.

[2]丁利君, 沈建毅. 黄芪中黄酮类化合物提取及其对羟自由清除作用[J]. 食品与机械, 2002(3): 20-21.

[3]LUTHRIA D L. Significance of sample preparation in developing analytical methodologies for accurate estimation of bioactive compounds in functional foods[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86(14): 2266-2272.

[4]SILVA T M S, CAMARA C A, da SILVA LINS A C, et al. Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen stingless bee melipona ducke[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2006, 19(11): 507-511.

[5]孙丽萍, 王大仟, 廖磊, 等. 油菜蜂花粉及其提取物对大鼠酒精性肝损伤组织学影响[J]. 食品科学, 2008, 29(7): 442-444.

[6]孙丽萍, 王大仟, 廖磊, 等. 油菜蜂花粉对大鼠酒精性肝损伤防治的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(10): 543-545.

[7]孙丽萍, 徐响. 超临界二氧化碳处理对油菜蜂花粉破壁的影响[J]. 食品科学, 2008, 29(6): 56-58.

[8]杨佳林, 孙丽萍, 徐响, 等. 油菜蜂花粉黄酮醇的测定及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2010, 31(3): 79-82.

[9]孙丽萍, 杨佳林, 徐响, 等. 油菜蜂花粉酚类化合物的初步分离和抗氧化性研究[J]. 食品科学, 2009, 30(23): 33-35.

[10]林兴, 黄权芳, 张士军, 等. 六月青总皂苷对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的脂质过氧化反应的影响[J]. 中成药, 2009, 31(12): 1937-1939.

[11]杨佳林, 孙丽萍, 徐响, 等. 油菜蜂花粉黄酮醇的测定及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2010, 31(3): 79-82.

[12]吴超, 苏红利, 张晓鸣. 银杏叶提取物制取黄酮苷元的酶解工艺研究[J]. 食品与机械, 2005, 21(6): 27-31.

[13]许妍妍, 张煜. 蜂胶与冠心病心绞痛[J]. 吉林医学, 2009, 30(3): 273-275.

[14]陈时宏. 黄酮类化合物的抗氧作用及其构效关系[J]. 海峡药学, 1998, 10(4): 4-6.

Anti-oxidant Effect of Flavonoid Glycosides from Rape Bee Pollen

SUN Li-ping1，XU Xiang1，LIAO Lei2，LIU Kui-ying2，YANG Jia-lin1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Beijing Clinical Pharmacy Institute, Beijing 100035, China)

Flavonoid glycosides were prepared from rape bee pollen, and their ability to scavenge DPPH free radicals and reducing power in simulated chemical systems were determined. The antioxidant activity of the extracted flavonoid glycosides was not as strong as that of kaempferol or quercetin. The antioxidant activity of the extracted compounds in vivo against CCl4-induced lipid peroxidation in mice was investigated, and the antioxidant mechanisms were also elucidated. The results showed that the extract could significantly inhibit the generation of MDA in liver, and increase the level of T-AOC in liver and serum. The possible antioxidant mechanism was the generation of flavonoid aglycone with plentiful antioxidant phenolic groups due to the hydrolysis of flavonoid glycosides by in vivo relevant enzymes. Therefore, flavonoid glycosides derived from rape bee pollen had a good protective effect against in vivo oxidative damage.

rape bee pollen；flavonoid glycosides；antioxidant activity；lipid peroxidation

S896.4

A

1002-6630(2010)19-0359-04

2010-06-28

农业部公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-041)；国家现代农业(蜂)产业技术体系建设专项(NYCYTX-43)；

中国农业科学院科研经费项目

孙丽萍(1963—)，女，研究员，硕士，研究方向为蜂产品功能因子的分离与纯化。E-mail：caasun@126.com