姜黄素对小鼠红细胞膜唾液酸和封闭度的影响

贾绍华,张舜尧,彭海生

姜黄素(Curcumin)是从姜科植物姜黄(curcuma longa L.)的根茎中提取的一种酚类色素,不溶于水,易溶于冰醋酸和碱性溶液[1].研究表明,姜黄素具有多方面的药理活性,如抗氧化、利胆抗炎、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗肿瘤[2]等作用外,还具有提高免疫功能的作用[3-5].前期实验研究表明,姜黄素能够显著地升高红细胞黏附肿瘤细胞的花环率,提高红细胞C3b受体花环促进率,降低其抑制率及提高红细胞膜的流动性[6].本实验继续从红细胞免疫出发,通过其对红细胞膜唾液酸水平和封闭度的影响的研究来进一步探讨姜黄素抗肿瘤的作用机制.

1 实验材料与仪器

1.1 主要药品及试剂

姜黄素(纯度≥99%,购自四川金郁金科技开发有限公司.以二甲亚砜(DMSO)作为溶剂,稀释成0.1 mmol/L的溶液,等量分装,-20℃保存[7]);5-Fu(上海旭东海普药业有限公司);考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒;SA试剂盒(南京建成生物工程研究所);皂素(上海化学试剂采购供应站);DPH(Sigma公司)等.

1.2 动物及瘤株

昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±2)g,由哈尔滨市汉方实验鼠类养殖所提供,合格证号:00101006.瘤株:H22荷瘤小鼠,购自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院.

1.3 主要仪器

RF-540荧光分光光度计(日本岛津公司);紫外721分光光度计(山东高密分析仪器厂);水平高速离心机(北京医用离心机厂);低温超速离心机(美国贝克曼公司).

2 实验方法

2.1 动物分组、建立模型和给药

小鼠按随机数字表随机分为5组,每组10只.给药组分别为姜黄素高(200 mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)剂量组,阳性对照组选用5-Fu组(30 mg/kg),模型对照组给予相同体积的生理盐水.无菌条件下抽取生长状态良好的H22荷瘤小鼠腹水,以生理盐水(1∶4)稀释后,使肿瘤细胞数为5.6×105个/mL.每只0.2m L接种于各组小鼠腹腔,接种24 h后.次日各组小鼠sc注射相应试剂.每天1次,连续给药7 d,于次日处死.

2.2 红细胞膜SA水平的测定

使用试剂盒对红细胞膜蛋白定量并测定SA水平,用分光光度计于560 nm波长处,读取各管吸光度(A)值.

2.3 红细胞膜封闭度的测定

2.3.1 红细胞影泡的制备

1)不封闭影泡的制备

给药7 d后次日小鼠眼球取血,肝素抗凝,在水平高速离心机下3 000 r/min离心10min,以生理盐水(1∶3)洗涤2次,1∶1悬浮在生理盐水中,得到红细胞悬液,按1∶30加入预冷的双蒸水或5P 8.4的等渗磷酸缓冲液(PBS),4℃下溶血,过夜,制成红细胞溶血液.4℃下以2 000 r/min离心40 min,弃上清液,用5P8.4PBS洗涤3次,最后悬浮在一定量PBS中,制成影泡悬浮液.

2)封闭影泡的制备

影泡悬浮液在37日℃下水浴1 h,可获得封闭影泡.

2.3.2 NADH-细胞色素C氧化还原酶活性的测定

按Zamudio[8]法进行:取4个试管,分别为不加皂素空白管(A),不加皂素样品管(B),加皂素空白管(C),加皂素样品管(D).首先在A、B、C、D管中都加入0.6 m L封闭影泡,第2步加入5P8.4的PBS,A管2.4mL,B管2.2 mL,C管2.2mL,D管2.0mL;第3步A、B管不加试剂,C、D管加入0.1%皂素各0.2mL;第4步A、C管不加试剂,B、D管加入5mmol/L K3Fe(CN)6各0.1 mL放置10m in;第5步A、C管不加任何试剂,B、D管各加6mmol/LNADH 0.1mL,加完计时1min后,混匀,在波长420 nm处比色,以加入NADH为起点,记录反应开始6min内的吸光度值(每隔1 min记录1次).上述反应在25℃进行.比色对照,除不加NADH溶液外其他操作同上.

2.3.3 红细胞膜封闭度的计算方法:

封闭度=(加表面活性剂酶活力-不加表面活性剂酶活力)/加表面活性剂酶活力 ×100%

3 实验结果

3.1 姜黄素对H22荷瘤小鼠红细胞膜SA水平的影响

结果见表1.结果显示,与对照组比较,姜黄素低、中、高剂量组均可显著地提高H22小鼠红细胞膜上SA水平(P＜0.05),且阳性对照组5-Fu也可提高SA水平.

表1 姜黄素对H 22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜表面唾液酸含量的影响n=10)

表1 姜黄素对H 22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜表面唾液酸含量的影响n=10)

注:与阴性对照组比较:*P＜0.05

组别 剂量/(mg◦kg-1)SA/(mmol◦L-1)封闭度/%对照组 —0.1854±0.0146 48.41±1.31 5-Fu组30 0.2263±0.0036*56.06±2.57*Cur组50 0.2029±0.0176*54.52±3.03*100 0.2253±0.0046*59.11±1.69*200 0.2355±0.0124*62.84±3.69*

3.2 姜黄素对H22荷瘤小鼠红细胞膜封闭度的影响

结果见表1与对照组比较,姜黄素低、中、高剂量组均可显著地提高H22小鼠红细胞膜上唾液酸含量(P＜0.05),且阳性对照组5-Fu也具有相似的结果.

4 讨 论

姜黄素具有抗肿瘤作用是其重要药理活性之一,包括诱导肿瘤细胞凋亡、分化及增殖等作用,本身还具有免疫增强作用.M Churchill等研究[9]表明姜黄素可以通过提高实验动物的CD4(+)T细胞和B细胞水平来提高动物的免疫活性.红细胞为机体内重要的血细胞,也是机体内重要的免疫细胞,1981年Siegel[10]提出了红细胞免疫系统(Red-cell immune system)的新概念,开辟了机体免疫系统的新领域.现已证实,红细胞具有识别、黏附、杀伤抗原、清除免疫复合物,而且参与机体免疫调控,其本身还存在有完整的自我调控系统,是完整机体免疫系统中的一个子系统[11].

唾液酸是细胞膜上糖蛋白和糖脂糖链末端的残基,广泛分布于哺乳动物细胞膜表面,为细胞负电荷的主要来源,亦为细胞膜受体的重要成分[12],参与细胞分化、癌细胞的转移、细胞的识别、黏附和接触抑制等生理过程,决定着细胞膜的重要特征.因此,细胞膜上唾液酸含量的改变将导致细胞内一系列生物学变化.红细胞免疫功能随着肿瘤的发展呈下降趋势,在肿瘤侵袭早期和中期下降最为迅速,而肿瘤转移开始至肿瘤转移晚期以后,其下降速度减慢,认为这一改变可作为评估肿瘤发展程度的参考指标之一.红细胞膜表面亦含有唾液酸,肿瘤患者红细胞膜表面SA的减少,促进红细胞的老化,脆性增加,细胞易崩解破裂,影响红细胞的正常生理功能.实验结果显示,姜黄素可以显著地提高H22荷瘤小鼠唾液酸和封闭度水平,增强细胞膜活性而达到提高红细胞免疫功能的目的.

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[6]贾绍华,王巧玲,彭海生,等.姜黄素对荷瘤小鼠红细胞免疫功能的影响[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2009,25(6):657-660.

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