纯牛奶中18碳TFA及9C,11 T-CLA含量的测定研究

章萍萍，赵培城

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

纯牛奶中18碳TFA及9C,11 T-CLA含量的测定研究

章萍萍，赵培城

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

为了精确测量出纯牛奶中18碳TFA及9c，11t-CLA的含量，本实验通过毛细管气相色谱法，并采用内标法，对纯牛奶进行了检测，结果显示，纯牛奶中18碳脂肪酸的质量百分比约为35.43%，18碳TFA的质量百分比约为2.27%，而其中C18∶1-11t的质量百分比达到1.28%，占所有18碳TFA的一半以上，约为56.36%，同时，牛奶中C18∶2-9c，11t的质量百分比只为0.11%，其含量远少于TFA。

纯牛奶，18碳反式脂肪酸，9c，11t-共轭亚油酸，毛细管气相色谱法，内标法

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，随着科技的进步和人们健康意识的增强，相比食品的色香味，人们更看重食品的营养价值和安全性。脂肪含有对人体生长、代谢有影响的脂肪酸，包括饱和脂肪酸（SFA）、顺式脂肪酸（CFA）、反式脂肪酸（TFA）、共轭脂肪酸（CLA）等，这些脂肪酸具有广泛的生理活性和生物学效应。已有研究表明，TFA会增加患心血管病的危险性，影响中枢神经系统的发育，特别是对婴幼儿和儿童的危害更大，会增加孩子的学习障碍，抑制生长发育等［1］。而CLA具有提高机体免疫机能、防止动脉粥样硬化、抗氧化等作用［2］。牛奶含有人体所需要的全部营养物质，是全营养食物，尤其是婴幼儿和儿童最主要的食物来源之一，在三聚氰胺事件以后，人们对牛奶中各成分的含量更加关注，牛奶中脂肪酸的构成及对其质量的影响也逐渐引起人们的重视。本实验用毛细管气相色谱法精确测定了纯牛奶中18碳TFA及9c，11t-CLA的含量，并进一步评价了纯牛奶的营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纯牛奶样品 杭州新希望双峰乳品，购于超市；C17∶0、C18∶1-11t、C18∶2-9t，12t、C18∶2-9c，12t、C18∶2-9t，12c、C18∶2-9c，12c、C18∶3-9t，12t，15t、C18∶3-9c，12c，15c脂肪酸甲酯标准品；C18∶3-9t，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15t脂肪酸甲酯混合标准品；C18∶3-9c，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15c脂肪酸甲酯混合标准品；C16∶0、C18∶0、C18∶1-9c、C18∶1-9t、C18∶1-11c、C18∶2-9c，11t、C20∶0脂肪酸标准品；质量分数为10%的三氟化硼甲醇溶液 分析纯，Sigma公司；体积分数为25%的氨水溶液、无水乙醇、乙醚、石油醚、氮气、正已烷 均为分析纯；2mol/L KOH-甲醇溶液取11.202g KOH，溶于约50mL无水甲醇中（温和加热，不得用明火加热），冷却至室温，用甲醇定容至100mL，加入约5g无水硫酸钠，充分搅拌后过滤，保留滤液。

ZFQ-85B型旋转蒸发仪 上海医械专机厂；日本岛津GC-2010型气相色谱仪 配有氢火焰离子化检测器，岛津仪器有限公司；CP-Sil88型石英交联毛细管柱 100m×0.25mm×0.20μm，南京伽诺仪器仪表有限公司。

式中：ms-加入样品中的内标物质（C17∶0）的质量，单位为毫克（mg）；As-加入样品中的内标物质（C17∶0）的包谱峰面积；Ai-成分i脂肪酸的色谱峰面积；m-称取脂肪的质量，单位为毫克（mg）。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酸甲酯混合标准品的制备 分别称取一定量的C16∶0、C18∶0、C18∶1-9c、C18∶1-9t、C18∶1-11c、C18∶2-9c，11t、C20∶0脂肪酸标准品于50mL圆底烧瓶中，加入10mL质量分数为10%的三氟化硼甲醇溶液，回流1h后，从冷凝管顶部加入正已烷，混合后取下冷凝管，加入20mL饱和NaCl溶液，剧烈振摇，继续加入饱和NaCl溶液至烧瓶颈部，静置分层，取上清液，得脂肪酸甲酯混合标准品一［3］。

将C18∶1-11t、C18∶2-9t，12t、C18∶2-9c，12t、C18∶2-9t，12c、C18∶2-9c，12c、C18∶3-9t，12t，15t、C18∶3-9c，12c，15c、C18∶3-9t，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15t、C18∶3-9c，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15c脂肪酸甲酯标准品混合，用正已烷定容，得脂肪酸甲酯混合标准品二。

将C17∶0脂肪酸甲酯标准品用正已烷定容，得其浓度为9.29mg/mL。

将脂肪酸甲酯混合标准品一、脂肪酸甲酯混合标准品二、C17∶0脂肪酸甲酯标准品混合，即得脂肪酸甲酯混合标准品。

1.2.2 纯牛奶中脂肪的提取［4］量取200mL纯牛奶于1000mL烧杯中，加入100mL体积分数为25%的氨水溶液，置于65℃水浴中加热约50min，每隔5min用玻璃棒搅拌一次，取出后冷却至室温。加100mL无水乙醇，混匀。加入250mL乙醚，振摇1min，加入250mL石油醚，振摇1min。静止分层，有机层转入1000mL圆底烧瓶中。第二次提取加入的试剂为100mL乙醇、200mL乙醚、200mL石油醚，操作同前。第三次提取不加乙醇，只加150mL乙醚、150mL石油醚，如上操作。把提取的醚液合并，在40℃下旋转蒸发至近干，再用氮气吹干，经真空干燥至恒重，即得乳脂样品，称重，低温保存备用。

1.2.3 乳脂样品的甲酯化［5］称取一定量乳脂样品，用正已烷配成浓度为1.004mg/mL的乳脂样品溶液，取3mL该溶液，加入2mL 2mol/L KOH-甲醇溶液，振摇至溶液澄清，静置分层，取1mL上清液，加入20μL 9.29mg/mL C17∶0脂肪酸甲酯标准品做内标物，用于气相色谱分析；另取1mL上清液，直接用于气相色谱分析，作为对照。

1.2.4 气相色谱分析条件［5］色谱柱：CPTM-Sil 88 FAME毛细管石英柱（100m×0.25mm×0.25μm）；柱温：初始温度60℃，保持5min，以5℃/min升温至165℃，保持1min，再以2℃/min升温至225℃，保持17min；检测器：氢焰离子化检测器（FID）；检测器温度：250℃；进样口温度：250℃；氢气流速：30mL/min；空气流速：400mL/min；进样方式：自动进样；载气：氮气，纯度不低于99.99%；柱流量：1.22mL/min；不分流。

1.2.5 结果计算 某种脂肪酸占总脂肪的质量分数（Xi）按下式计算：

2 结果与讨论

2.1 峰的鉴定

图1为脂肪酸甲酯标准品的气相图谱。由图1可以看出，该气相色谱分析方法能使不同结构的脂肪酸甲酯得到很好的分离，同时可以得出，脂肪酸甲酯的保留时间与碳链长度、不饱和度及顺反构型等因素有关。随着碳数的增加，脂肪酸甲酯的出峰时间推迟，但C20∶0的出峰时间在C18∶2与C18∶3之间；相同碳数的脂肪酸甲酯不饱和度越大，保留时间越长，即保留时间：C18∶0＜C18∶1＜C18∶2＜C18∶3，但9c，11t-CLA的出峰时间在C18∶3-9c，12c，15c之后；相同碳数、相同不饱和度的脂肪酸甲酯，顺式脂肪酸甲酯比反式脂肪酸甲酯的出峰时间晚，即保留时间：顺式脂肪酸＞反式脂肪酸；相同碳数，相同构型的脂肪酸甲酯的保留时间受双键位置的影响，双键离酯酰基的位置越远，保留时间越长，即保留时间Δ9＜Δ11＜Δ12＜Δ15。

图1 脂肪酸甲酯标准品气相图谱

2.2 乳脂样品中脂肪酸含量的分析

为了精确测定乳脂样品中脂肪酸含量，本实验采用内标法，且内标物采用乳脂样品中含量较少的C17∶0。图2为未加C17∶0内标物的乳脂样品气相图谱，图3为加C17∶0内标物的乳脂样品气相图谱。

将图2及图3相比较可以看出，加内标物与未加内标物的乳脂样品气相图谱的重合性非常好，同时，饱和脂肪酸、顺式脂肪酸、反式脂肪酸及共轭脂肪酸能够很好地分离，因此可通过记算C17∶0的峰面积来计算乳脂中不同脂肪酸的含量。

通过计算，可以得出，乳脂中18碳脂肪酸的质量百分比约为35.43%，18碳反式脂肪酸的质量百分比约为2.27%，而其中C18∶1-11t的质量百分比达到1.28%，占所有18碳反式脂肪酸的一半以上，约为56.36%。同时，乳脂样品中C18∶2-9c，11t的质量百分比只为0.11%。

注：1：C16∶0；2：C17∶0；3：C18∶0；4：C18∶1-11t；5：C18∶1-9c；6：C18∶2-9c，12c；7：C18∶3-9c，12c，15c；8：C18∶2-9c，11t，图3同。

图3 乳脂样品气相图谱（加C17∶0内标物）

目前国际对食品中反式脂肪酸含量的限量标准为少于2%，而通过本实验的测定可知，纯牛奶中仅18碳反式脂肪酸的质量分数就达到约2.27%，其含量还是偏高，共轭亚油酸由于其具有提高机体免疫机能、防止动脉粥样硬化、抗氧化等作用，故在牛奶中应提高CLA的含量，通过本实验的检测可知，牛奶中CLA的含量远少于TFA，因此对于牛奶中反式脂肪酸消解技术的研究迫在眉睫，而这其中尤其是对C18∶1-11t的消解。在反刍动物体内，C18∶1-11t可在肝脏和乳腺细胞中被 Δ9脱氢酶脱氢，生成9c，11t-CLA。Pollard等人［6］曾从大鼠的肝脏微粒体中分离得到Δ9脱氢酶，据此，可进一步研究利用Δ9脱氢酶将C18∶1-11t转化成9c，11t-CLA的体外实验过程，从而达到既减少牛奶中TFA含量，又增加CLA含量的效果。

3 结论

本实验通过毛细管气相色谱法，利用内标法，对纯牛奶中18碳反式脂肪酸及9c，11t-CLA的含量进行了检测，结果得出，纯牛奶中18碳脂肪酸的质量百分比约为35.43%，18碳反式脂肪酸的质量百分比约为2.27%，而其中C18∶1-11t的质量百分比达到1.28%，占所有18碳反式脂肪酸的一半以上，约为56.36%，这离国际对食品中反式脂肪酸含量的限量标准2%还有一定差距。同时，牛奶中C18∶2-9c，11t的质量百分比只为0.11%，其含量远少于TFA，因此可利用Δ9脱氢酶将C18∶1-11t转化成9c，11t-CLA，从而达到既减少牛奶中TFA含量，又增加CLA含量的效果。

［1］赖晓英，武德银，伍飏，等.反式脂肪酸的危害及其检测方法［J］.现代食品科技，2006，23（2）：73-76.

［2］王丽芳，卢德勋，马燕芬.共轭亚油酸的来源及其生物学作用［J］.乳业科学与技术，2008（2）：93-96.

［3］GB/T 17376-2008/ISO 5509：2000.动植物油脂脂肪酸甲酯制备［S］.

［4］吴广臣.食品质量检验［M］.北京：中国计量出版社，2008：65-67.

［5］GB/T 22110—2008.食品中反式脂肪酸的测定气相色谱法［S］.

［6］Pollard M R，Gunstone F D，James A T，et al.Desaturation of Positional and Geometric Isomers of Monoenoic Fatty Acids by Microsomal Preparations from Rat Liver［J］.Lipids，1980，15（5）：306-314.

Study on 18-carbon trans fatty acid and 9c，11t-conjugated linoleic acid contents in milk

ZHANG Ping-ping，ZHAO Pei-cheng
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

ln order to determine the contents of 18-carbon TFA and 9c，11t-CLA in milk，internal standard method of capillary column-gas chromatography was used.According to the result，the mass percents of 18-carbon fatty acids，18-carbon TFA，C18∶1-11t in milk were about 35.43%，2.27%，1.28%，respectively.And more than half of 18-carbon TFA in milk was C18∶1-11t，about 56.36%.But the mass percent of C18∶2-9c，11t in milk was only about 0.11%，which was much less than the 18-carbon TFA contents of milk.

milk；18-carbon trans fatty acid；9c，11t-conjugated linoleic acid；capillary column-gas chromatography；internal standard

TS252.7

A

1002-0306（2010）12-0355-03

2010-01-19

章萍萍（1985-），女，在读硕士，研究方向：食品生物技术。