细胞周期蛋白在喉癌组织中的表达及意义

刘馨莲 殷 舞 李淑蓉 孙 静

喉癌(laryngeal carcinoma)是头颈部常见的恶性肿瘤，在我国该病约占全身肿瘤的1%～5%，列居9～16位，且近年来喉癌的发病率有着明显上升的趋势[1]。目前喉癌的病因仍不十分明确，可能与吸烟、饮酒、环境污染、病毒感染等因素有关。随着对细胞周期调控认识的不断深入，出现了“癌症可能是一类细胞周期性疾病(cell disease)”的观点。细胞分子生物学研究认为，肿瘤的本质在于细胞周期调控紊乱，细胞呈现失控性生长和凋亡减少[2]。体外研究发现，大多数细胞的细胞周期为10 ～48 h。主要分为4 期：G1期(DNA合成前期成期) 、S期(DNA合成期)、 G2期(DNA合成后期) 和M期(有丝分裂期)。细胞周期蛋白(Cyclins)作为细胞周期的正向调控因素，其异常表达是导致细胞周期调控机制受到破坏的主要原因之一，与恶性肿瘤发生发展密切相关[3]。本文采用免疫组化法，检测Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E 4种蛋白产物在喉癌组织中的表达情况，旨在探讨其与喉癌的发生、发展以及与临床各病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2007年9月～2010年2月广西壮族自治区人民医院手术切除的喉癌组织标本67例。其中男性42例，女性25例，年龄33～73岁，平均(53.2±8.7)岁；高分化22例，中分化27例，低分化18例；有淋巴结转移26例，无淋巴结转移41例；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期24例。另取32例距癌灶边缘0.5～1.0 cm的癌旁正常组织作为对照。全部病例均经病理检查确诊，且术前未行化疗或放疗，均有详细的临床病理资料、手术记录。全部标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.2 试剂

鼠抗人Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin E单克隆抗体购自BD Pharmingen公司，S-P试剂盒购自北京中杉生物技术开发公司，DAB试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 方法

免疫组化染色采用 S-P法。石蜡切片脱蜡水化后，微波抗原修复，过氧化酶阻断剂灭活内源性过氧化物酶活性，羊血清工作液封闭，滴加一抗4 ℃过夜，滴加生物素标记的二抗，滴加链亲和素一过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木精复染。以已知阳性组织切片作为阳性对照，用 PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断

Cyclin A、Cyclin E均以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，Cyclin D1、Cyclin B1以细胞核和细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。任意选择5个高倍视野，每个视野至少含100个细胞，阳性细胞数≥10%为阳性，<10%为阴性，分别计算阳性率。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行分析，应用t检验和χ2检验，以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 Cyclin D1在癌旁正常组织和喉癌组织中的表达

喉癌组织中Cyclin D1表达阳性率为64.2%(43/67)，明显高于正常喉黏膜组织[15.6%(5/32)]，有统计学差异(P<0.05)。随着喉癌组织分化程度下降，其阳性率逐渐增高(表1) (P<0.05)。Cyclin D1高表达与肿瘤有无淋巴结转移有关(表1) (P<0.05)，但经统计学分析发现，Cyclin D1高表达与患者性别及临床分期无关(表1)。

2.2 Cyclin A在癌旁正常组织和喉癌组织中的表达

喉癌组织中Cyclin A表达阳性率为59.7%(40/67)，明显高于正常喉黏膜组织[9.4%(3/32)]，有统计学差异(P<0.05)。随着喉癌组织分化程度下降，其阳性率逐渐增高(表1) (P<0.05)。CyclinA高表达与肿瘤有无淋巴结转移相关(表1) (P<0.05)，但经统计学分析发现，CyclinA高表达与患者性别及临床分期无关(表1)。

2.3 Cyclin B1在癌旁正常组织和喉癌组织中的表达

喉癌组织中Cyclin B1表达阳性率为71.6%(48/67)，明显高于正常喉黏膜组织[12.5%(4/32)]，有统计学差异(P<0.05)。随着喉癌组织分化程度下降，其阳性率逐渐增高(表1) (P<0.05)。Cyclin B1高表达与肿瘤有无淋巴结转移相关(表1) (P<0.05)，但经统计学分析发现，Cyclin B1高表达与患者性别及临床分期无关(表1)。

2.4 Cyclin E在癌旁正常组织和喉癌组织中的表达

喉癌组织中Cyclin E表达阳性率为62.7%(42/67)，明显高于正常喉黏膜组织[9.45%(3/32)]，有统计学差异(P<0.05)。随着喉癌组织分化程度下降，其阳性率逐渐增高(表1) (P<0.05)。Cyclin E高表达与肿瘤有无淋巴结转移相关(表1) (P<0.05)，但经统计学分析发现，Cyclin E高表达与患者性别及临床分期无关(表1)。

表1 Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E表达及与喉癌临床病理特征的关系(例，%)

3 讨论

肿瘤的发生是多步骤、多因子参与的过程。近年来，分子肿瘤学研究表明，细胞周期调节失控在恶性肿瘤发生中起着关键作用，细胞周期的进程主要依靠细胞周期蛋白 (Cyclins)，细胞周期素依赖激酶( cyclin dependent kinase,CDK )和细胞周期素依赖激酶抑制剂 (cyclin dependent kinase inhibitor,CKI) 三者的形成、激活及相互作用进行调节。其中，Cyclins是正向调控CDK活性的关键蛋白，其有规律的时相性表达是驱动细胞周期正常运行的必要条件。Cyclins异常表达可破坏细胞周期的调控平衡，是导致细胞失控性生长、恶性转化的重要因素；反过来，Cyclins的表达状况也可以反映细胞周期的正常与否、肿瘤的进展状态及归宿。在人类肿瘤细胞中，已经发现多种细胞周期蛋白的异常表达。近年研究表明，细胞周期蛋白在肿瘤发生、发展中起重要作用，对判断肿瘤的生物学特征、预后、指导临床治疗有重要的意义。

Cyclin D1是细胞周期蛋白家族中的重要一员它与相应的CDK结合，形成 Cyclin-CDK复合物，导致CDK激酶活化，使细胞分裂由G1期进入S期[4]。在细胞周期中，G1/S期调控点是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核，对细胞增殖进行调控的关键点，该点调控的异常与肿瘤的发生发展关系密切[5]。Cyclin D1是G1/S转换的正性调控因子[6]，当Cyclin D1扩增或过表达时，G1/S期缩短，促使细胞增殖，导致癌变。本研究结果显示Cyclin D1在癌旁正常组织中低表达，在喉癌组织中Cyclin D1高表达，且其表达水平随着肿瘤分化程度降低而升高，说明喉癌组织中Cyclin D1的表达是存在的，并且在喉癌的发生发展过程中起重要作用，与肿瘤的恶性程度密切相关。

Cyclin A在G1期表达呈阴性或表达水平极低，随S期的进展而升高，在G2/M期的表达达到高峰。Cyclin A在G1/S和G2/M转换中均发挥重要作用[7]，既是G1向S期限速步骤，也促进G2期向M期转换。Cyclin A与CDK2 结合使其活化，活化的CDK2 又磷酸化一系列底物，从而对DNA 合成与有丝分裂等进行调控。研究表明，Cyclin A 表达异常可使细胞周期发生改变，与多种肿瘤的形成、进展状态及预后等相关[8]。本研究结果显示，Cyclin A在癌旁正常组织中低表达，在喉癌组织中Cyclin A高表达，且其表达水平随着肿瘤分化程度降低而升高，提示随着肿瘤级别的增加，有越来越多的细胞增殖活跃。

Cyclin B1 是控制细胞进入G2/M期的关键因子，它与CDK1 的结合是M期事件启动和进行的必要条件，它最早出现于G1期，主要合成于S/G2期，在G2/M期表达最高，有丝分裂结束后迅速被泛素化降解(ubiquitination)[9，10]。Cyclin B1与CDK1结合后形成CDK1/ Cyclin B1 激酶复合物，催化一系列底物的磷酸化，从而使细胞进入有丝分裂期[11]。Cyclin B1是所有细胞周期素中惟一一个随细胞周期改变而发生位置转移的细胞周期素，在细胞有丝分裂间期，Cyclin B1分布于细胞质中，但到有丝分裂开始时，在核膜断裂之前，快速转位到细胞核中。本研究结果显示Cyclin B1在在癌旁正常组织中低表达，在喉癌组织中Cyclin B1高表达，且其表达水平随着肿瘤分化程度降低而升高，提示Cyclin B1的过表达可使进入G2/M期的细胞百分比增加，从而影响细胞周期的进程，促进细胞增殖。

Cyclin E是1种从酿酒酵母菌中提取出来核蛋白[12]，细胞周期分子生物学研究表明，Cyclin E表达升高始于G1中期，至G1晚期的G1/ S转换点达到高峰，而后随细胞进入S期，Cyclin E开始下降，到G2/ M 期降为零，Cyclin E是细胞从G1期向S期转换的主要限速因素之一。Cyclin E与细胞周期素依赖激酶2( CDK2) 结合在细胞周期G1/S晚期起作用。其过度表达能加速G1/S转化，缩短G1期进程，导致细胞提前进入S期，干扰DNA、中心体复制和分裂，导致基因不稳定并可能出现染色体不均等分裂和非整倍体等核型异常，进而引起细胞的转化和肿瘤生成[13～15]。本研究结果显示，Cyclin E在在癌旁正常组织中低表达，在喉癌组织中Cyclin E高表达，且其表达水平随着肿瘤分化程度降低而升高，说明在喉癌组织中存在Cyclin E高表达，表明处于分裂增生状态的Cyclin E表达增强，激活CDKs，促进细胞进入S期，无限增生而导致癌症发生。

综上所述，Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E蛋白表达在喉癌的不同级别和淋巴结转移方面具有差异，为判断喉癌细胞的增殖活性提供了依据，说明Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E的表达喉癌的发生、发展过程中起重要作用，是判断喉癌恶性程度的重要参考指标，可辅助常规病理诊断并为判断预后提供信息。

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