甘松挥发油β-环糊精包合工艺研究

王静，邢煜军，张保国，李钦*

(1.河南大学中药研究所，河南开封475004;2.河南大学药学院，河南开封475004)

甘松为败酱科植物甘松Nardostachys chinensisBatla.或匙叶甘松Nardostachys jatamansiDC.的干燥根及根茎，其味辛、甘，性温，具有理气止痛，开郁醒脾之功效［1］。是目前败酱科中唯一被《中国药典》2010年版收载的药用植物，甘松的主要成分为挥发油［2］。

现代药理研究表明，甘松挥发油有镇静、解痉、降压、抗心律失常、抑菌等作用，但有刺激性气味，而β-环糊精包合物有增加药物溶解度、液体药物粉末化以及防止挥发油挥发的作用［3］，本实验利用β-环糊精对甘松挥发油进行包合，比较3种包合物制备方法，并通过正交实验优选出最佳包合工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器TB-Ⅲ型恒温磁力搅拌器(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，KQ5200DA型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FA1004电子天平(十万分之一，上海楚定分析仪器有限公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药甘松(购自开封市天济大药房，经河南大学中药研究所李钦教授鉴定为甘松Nardostachy chinensisBatla.的干燥根及根茎)，β-环糊精(孟州市华兴生物化工有限责任公司)，其余试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 挥发油的提取取甘松药材(过20目筛)适量，加10倍量水，浸泡3 h，按水蒸气蒸馏法提取挥发油6 h，用无水硫酸钠脱水后即得，挥发油提取率约为2.5%，相对密度为0.967 g/mL。

2.2 包合方法的筛选β-环糊精包合物常用的制备方法有饱和水溶液法、研磨法和超声法［4］，参考相关文献［5］，本实验分别采用3种方法对甘松挥发油进行包合。

2.2.1 包合物的制备

2.2.1.1 饱和溶液法精密称取β-环糊精6 g，加蒸馏水75 mL置恒温磁力搅拌器上，60℃搅拌溶解，使成饱和溶液，缓缓滴加挥发油1 mL(事先用无水乙醇4 mL稀释)，恒温搅拌0.5 h，冷却至室温，放入冰箱冷藏24 h，抽滤，包合物用石油醚冲洗3次(10 mL/次)，室温放置过夜，自然挥干，即得β-环糊精包合物。

2.2.1.2 研磨法精密称取β-环糊精6 g，加4倍量蒸馏水研磨3 min后，用滴管缓缓加入1 mL挥发油(事先用4 mL无水乙醇稀释)，研磨0.5 h，放入冰箱中冷藏24 h，抽滤，以下操作同饱和水溶液法。

2.2.1.3 超声法精密称取β-环糊精6 g于具塞三角瓶中，加入蒸馏水75 mL，超声使混和均匀，取1 mL挥发油(事先用无水乙醇4 mL稀释)，在超声过程中逐滴加入，温度控制在60℃，超声0.5 h，取出，冷却至室温，放入冰箱冷藏24 h，抽滤，以下操作同饱和溶液法。

2.2.2 挥发油空白回收率测定方法精密量取挥发油1 mL置500 mL圆底烧瓶中，加蒸馏水200 mL，按《中国药典》2010年版一部附录X D挥发油测定法甲法测定，收集挥发油至油不再增加为止，计算挥发油的空白回收率为88%，空白回收率=［收集挥发油量(mL)/加入挥发油量(mL)］×100%，结果见表1。

表1 空白回收率实验(n=3)

2.2.3 包合物中挥发油的测定分别取以上3种制备方法制得的β-环糊精包合物6 g于500 mL圆底烧瓶内，加蒸馏水200 mL，按《中国药典》2010年版一部附录X D挥发油测定法甲法提取挥发油，对油利用率、包合物收率及含油率3个指标进行考察时，根据实际生产情况，挥发油利用率权重系数为0.6，包合物收率为0.3，含油率为0.1，进行综合评价，结果见表2。研磨法优于另两种方法。

表2 3种包合方法的比较(±s，n=3)

表2 3种包合方法的比较(±s，n=3)

研磨法72.92±0.78饱和水溶液法57.86±0.76超声法40.53±0.55

2.2.4 考察指标

①包合率(%)=［包合物含油量(mL)/(挥发油投入量(mL)×空白回收率］×100%。

②包合物收率(%)=［包合物质量(g)/β-环糊精质量(g)+挥发油质量(g)］×100%。

③包合物含油率(%)=［包合物提取的挥发油质量(g)/包合物质量(g)］×100%。

④综合评分=包合率×0.6+包合物收率×0.3+含油率×0.1。

2.3 包合工艺条件的考察

2.3.1 无水乙醇与95%乙醇稀释挥发油包合效果的考察

精密称取β-环糊精6 g，2份，分别于研钵中，加4倍量蒸馏水，研磨3 min，缓慢加入1 mL挥发油(分别用无水乙醇和95%乙醇4 mL稀释)，再研磨30 min，抽滤，包合物用少量水洗后再用石油醚冲洗3次(10 mL/次)，室温放置过夜，自然挥干，即得β-环糊精包合物，按2.2.3项及2.2.4项的方法，测定包合物中挥发油的量，结果表明，用无水乙醇稀释挥发油包合效果优于95%乙醇(见表3)。

2.3.2 无水乙醇用量包合挥发油效果的考察精密称取β-环糊精6 g，3份，分别于研钵中，加入4倍量蒸馏水，研磨3 min，缓慢加入1 m L挥发油(事先分别用2 mL，4 mL，6 mL无水乙醇稀释)，再研磨0.5 h，抽滤，包合物用少量水洗后再用石油醚冲洗3次(10 mL/次)，室温放置过夜，自然挥干，即得β-环糊精包合物按2.2.3项及2.2.4项的方法，测定包合物中挥发油的含量，结果表明，4 mL无水乙醇稀释挥发油包合效果最好(见表4)。

表3 无水乙醇与95%乙醇稀释甘松挥发油包合结果(±s，n=3)

表3 无水乙醇与95%乙醇稀释甘松挥发油包合结果(±s，n=3)

包合物收率/%溶媒包合率/%包合物含油率/%综合评分无水乙醇77.27±1.97 84.79±2.31 11.14±0.78 72.92±0.78 95%乙醇58.35±1.29 83.13±1.66 8.15±1.15 60.75±0.70

表4 不同无水乙醇用量溶解甘松挥发油包合结果(±s，n=3)

表4 不同无水乙醇用量溶解甘松挥发油包合结果(±s，n=3)

2 62.40±0.77 4 72.92±0.78 71.28±1.14 6

2.4 正交试验优选包合工艺条件

2.4.1 正交试验选择β-环糊精与挥发油投料配比、β-环糊精与水配比、研磨时间3个因素，每个因素选取3个水平，以2.2.4项考察指标的综合评分为指标，采用L9(34)正交表安排试验，对研磨法进行考察，设计方案见表5，试验结果见表6，方差分析见表7。

表5 因素水平表

表6 甘松挥发油包合正交试验结果

2.4.2 结果分析从表6直观分析可以看出，影响包合效果的因素的顺序为A＞B＞C，从表7的方差分析可以看出，因素A、因素B对包合效果具有显著性影响，最终确定最佳包合工艺为:A2B1C2，即取β-环糊精6 g，蒸馏水12 mL，加挥发油1 mL，研磨30 min。

表7 方差分析结果

2.4.3 工艺试验按上述最佳包合条件，重复试验3次，结果平均包合物收率90.42%，平均包合率为96.97%，平均含油率为13.41%，因此确定该工艺为最佳包合条件。结果见表8。

表8 工艺试验结果(n=3)

2.4.4 包合物TLC验证取甘松挥发油5滴，加入石油醚5 m L，摇匀，制成供试品溶液1;取从包合物中提取的挥发油5滴，加入石油醚5 mL摇匀，制成供试品溶液2;取β-环糊精包合物0.1 g，加石油醚5 mL，超声处理20 min，滤过，滤液为供试品溶液3;取β-环糊精0.1 g，加石油醚5 mL，超声处理20 min，滤过，滤液为供试品溶液4;取β-环糊精0.1 g，加甘松挥发油5滴，再加石油醚5 mL，超声处理20 min，滤过，滤液为供试品溶液5。照《中国药典》2010年版一部薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述5种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品2与供试品5色谱中，在与供试品溶液1色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明包合前后挥发油主要成分无差异。在供试品溶液1斑点对应处，β-环糊精及β-环糊精包合物未见斑点，说明挥发油已形成包合物而非混和物(见图1)。

图1 包合物中挥发油TLC图

3 讨论

3.1 在制备过程中，包合物溶液冷藏1 d后，抽滤，需用石油醚洗去残留在包合物外面的挥发油，以免影响挥发油利用率。

3.2 进行空白回收率测定，是因为尽管提取至挥发油量不再增加，但热水中仍留少量的挥发油，为减小误差，需对结果进行校正。

3.3 β-环糊精包合物验证方法有X射线衍射法、紫外光谱法、红外光谱法、薄层色谱法、显微观察法、热分析法等［6-8］，本试验选用薄层色谱法，操作简便，准确度较高。包合前后挥发油中主要成分没有明显改变，可能是由于β-环糊精分子与甘松挥发油的包合主要是由于分子间吸引力的作用。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:80.

［2］张旭，兰洲，董小萍，等.甘松有效成分研究［J］.中药材，2007，30(1):38-41.

［3］刘汉清主编.中药药剂学［M］.北京:中国医药科技出版社，2000:169-185.

［4］赵海霞，陈浩，田景振.环糊精包合技术［J］.山东中医杂志，2000，19(4):241.

［5］颜红，夏新华，陈镇.β-环糊精包合佛手、香附、木香混合挥发油的制备工艺研究［J］.医药导报，2005，11(3):59-61.

［6］王玮，蔡源源，靳蓉，等.醋柳黄酮包合物的X-射线衍射法鉴别及其脱包合研究［J］.河南大学学报:医学版，2008，27(4):32-35.

［7］钱平，刘志辉，钱芳.当归、甘松挥发油β-环糊精包合工艺研究［J］.中成药，2010，32(4):667-669.

［8］尤思路，高秀蓉，廖昌军.饱和水溶液法制备葛根素的β-环糊精包合物研究［J］.西南军医，2008，10(4):17-19.