CD4+CD25+调节性T细胞对内皮细胞抗原提呈功能的影响及机制①

何少林 李大主 黎 明 马旭明 林 静 昌 薇 赵 卉

（华中科技大学同济医学院协和医院心内科,武汉 430022）

CD4+CD25+调节性T细胞对内皮细胞抗原提呈功能的影响及机制①

何少林 李大主 黎 明 马旭明 林 静 昌 薇 赵 卉

（华中科技大学同济医学院协和医院心内科,武汉 430022）

目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）对内皮细胞抗原提呈功能的影响及机制。方法:磁性细胞分离器（MACS）分离CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞。在ox-LDL作用下,HUVECs与CD4+CD25+T细胞共培养,24小时后收集HUVECs。应用流式细胞术测定HUVECs抗原提呈分子（HLADR,CD86,CD80）的表达,Cell Counting Kit-8法（CCK-8）测定HUVECs刺激CD4+CD25-T细胞增殖的能力,Transwell小室实验初步探讨Treg作用于HUVECs的具体机制。结果:与对照组比较,Treg可显著抑制HUVECs抗原提呈分子的表达及刺激T细胞增殖的能力。用Transwell隔离后,与or-LDL刺激组比较,HUVECs抗原提呈分子表达及其刺激T细胞增殖的能力无明显变化。结论:Treg可显著抑制HUVECs抗原提呈能力,其作用机制可能为下调CD86的表达,且依赖细胞直接接触。

CD4+CD25+调节性T细胞;人脐静脉内皮细胞系;氧化型低密度脂蛋白;抗原提呈分子;细胞增殖;Transwell

动脉粥样硬化（AS）是一种炎症性疾病[1]。内皮损伤及由此介导的T细胞的活化,归巢与AS有关。血管内皮细胞具有抗原提呈作用,参与诸多炎性疾病的发生发展[2]。Treg可抑制AS,但具体机制不清[3]。我们既往研究表明Treg可抑制内皮细胞的炎症分泌功能,此作用可能部分与Treg抑制了内皮细胞表达CD86有关[4]。但其是否抑制内皮细胞抗原提呈功能及具体机制尚无报道。本文探讨Treg对内皮细胞抗原提呈功能的影响和可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂DMEM/F-12培养基购于Gibco-BRL公司,按说明书配制,4℃保存;特级胎牛血清购于杭州四季青生物制品公司,使用前56℃水浴30分钟灭活补体后分装,-20℃保存;ox-LDL购于Sigma公司;DMSO购于上海华美生物工程公司;人淋巴细胞分离液购于中国医学科学院生物医学工程研究所 ;FITC-anti human CD4、PE-anti human CD25、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞免疫磁珠（MACS）分选试剂盒购于德国Miltenyi Biotec公司;human HLA DR-PE 、human CD80-PE 、human CD86-PE、human IgGPE、human anti-CD3 mAb OKT3购于美国 eBioscience公司;CCK-8试剂盒购于日本同仁化学公司;DNA探针由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离与培养

1.2.1.1 HUVECs的培养及鉴定 取新生儿脐带,PBS洗净脐静脉腔后灌注0.1%Ⅰ型胶原酶,血管钳夹闭静脉两端,置 37℃水浴箱 12～15分钟,收集消化液,1 200 r/min离心10分钟,弃上清,加入内皮细胞培养基,置37℃、5%CO2孵育箱中培养24小时,PBS洗去红细胞及未贴壁细胞,加入含10%特级胎牛血清及内皮细胞生长添加物（100mg/L）的培养基中继续培养,2～3天换一次液。至贴壁细胞70%～80%融合时,用 0.25%胰蛋白酶消化传代,取3～5代用于试验。倒置相差显微镜下观察细胞呈单层鹅卵石样排列,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性,确定为内皮细胞。

1.2.1.2 CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞的分离及激活 以无菌注射器采集外周50ml（来自健康志愿者）,肝素抗凝,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）,收集的PBMC用CD4+CD25+Treg细胞免疫磁珠（MACS）分选试剂盒,阴性选择获得CD4+T细胞;加入PE标记抗小鼠CD25单克隆抗体,再加入磁珠标记抗PE,阳性选择获得CD4+CD25+T细胞,阴性选择获得CD4+CD25-T细胞,通过流式细胞仪（BD FACS Calibur）分析细胞纯度,经鉴定其纯度分别＞92%和＞98%。将分选后的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞分别用无血清DMEM/F-12培养基重悬,调整细胞至终浓度109cells/L,种入预先包被好human anti-CD3mAb OKT3（10 mg/L）的96孔板,每孔终体积100μl,孵育48小时。

1.2.2 Treg与HUVECs的共培养及分组 CD4+CD25+T细胞（均为5×105细胞/孔）与抗人CD3 mAb（10mg/L）孵育48小时后,加入种有融合已达90%的内皮细胞（3×106～4×106细胞/孔）的培养板中,在终浓度均为50mg/L的ox-LDL中共培养24小时,分为3组:（1）HUVECs组（control组）:HUVECs,不加任何刺激;（2）HUVECs+ox-LDL组（no T组）:HUVECs+ox-LDL;（3）HUVECs+ox-LDL+Treg组（CD25+组）:HUVECs+Treg+ox-LDL。细胞置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养。24小时后,移去培养液,用 PBS轻洗2遍,去除未粘附细胞,用0.25%胰蛋白酶液消化收集HUVECs备用。

1.2.3 流式细胞术检测HUVECs HLA DR,CD80,CD86的表达 收集上述处理过的各组单个HUVECs,离心弃上清,80μl PBS液重悬,每管加入单克隆抗体human HLA DR-PE或CD86-PE或CD80-PE各20μl,4℃孵育30分钟,加入含2%BSA,0.1%NaN3的PBS液,1 200 r/min离心,10分钟,反复洗2次。去上清,加入1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）500μl,流式细胞仪检测,其结果以阳性百分率表示。每份样本均设阴性对照（加相应IgG抗体）,以消除本底荧光的影响。

1.2.4 单相淋巴细胞增殖抑制试验 CCK-8试剂可简便而准确的测定细胞增殖。CD4+CD25+T细胞与抗人CD3mAbs（10mg/L）孵育48小时,离心重悬。将已被抗人CD3mAbs激活的不同浓度CD4+CD25+T细胞（HUVECs:Treg 分别为 :0∶1、1∶0、1∶1、1∶0.5、1∶0.25、1∶0.125,分别加入已种有 HUVECs（5×105细胞/孔）及终浓度均为50mg/L的ox-LDL的培养板中,在37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中共培养,24小时后胰蛋白酶液消化收集HUVECs,经6 000 rad辐照灭活,加入96孔U型板（Nunc）100μl/孔,设3个复孔,过夜培养使其贴壁,次日每孔吸出上清50μl,然后补加等体积的营养液,最后加100μl的CD4+CD25-T 细胞置于 37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中进行单向混合淋巴细胞培养5天。每个孔内加入10μlCCK-8,在培养箱内培养4小时后,酶标仪450 nm波长处测定吸光度（A）值。

1.2.5 Transwell实验 Tanswell上下小室间的通透膜孔径为0.4μm,可允许细胞因子自由通过,而Treg不能自由通过。实验分为4组:①HUVECs组（control组）:HUVECs,不加任何刺激;②ox-LDL诱导组（no T组）:HUVECs+50mg/Lox-LDL;③CD4+CD25+T细胞组（CD25+组）:HUVECs+CD4+CD25+T细胞+anti-CD3mAbs+50mg/L ox-LDL;④Transwell实验组（TW组）:下室中种入HUVECs,上室中种入CD4+CD25+T细胞+anti-CD3mAbs。48小时后,移走上室,下室中加入50mg/L ox-LDL。各组细胞均置5%CO2、37℃孵箱,培养24小时后收获HUVECs测定CD86的表达或行单相淋巴细胞增殖抑制试验。

1.3 统计学处理 以上各组实验至少独立重复三次,结果均用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。组间数据处理根据方差齐性分析的结果,进一步使用S-N-K检验进行组间差异的比较,P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 ox-LDL 对HUVECs 表面HLA DR、CD80、CD86表达的影响 流式细胞术表明:与control组比,no T组CD86及HLA DR均显著升高（P＜0.001）,而CD80表达无显著差异（P＞0.05,图1）。

图1 调节性T细胞对HUVECs表面HLA DR,CD80,CD86表达的影响Fig.1 Tregmodu lateexp ression of CD80,CD86 and HLA DR in HUVECs impaired by ox-LDL

图2 单相淋巴细胞增殖抑制试验Fig.2 The effect of Treg treated HUVECs on the p roliferation of CD4+CD25-T cells

2.2 Treg对ox-LDL诱导HUVECs表面HLA DR、CD80、CD86表达的影响 流式细胞术表明:与no T组比,CD25+组CD86表达显著下降（P＜0.01）,而HLA DR显著升高（P＜0.001）,CD80表达无显著差异（P＞0.05,图1）。

2.3 单相淋巴细胞增殖抑制试验 与HUVECs∶Treg为 0∶1 时比 ,HUVECs∶Treg 为 1∶0 时HUVECs刺激CD4+CD25-T细胞增殖的能力显著升高（P＜0.001）。而与HUVECs∶Treg为 1∶0时比,当加入的Treg逐渐升高时,HUVECs刺激CD4+CD25-T细胞增殖的能力逐渐下降（所有P＜0.05,图2）。

2.4 Treg对HUVECs的抑制作用依赖于细胞直接接触和细胞因子

2.4.1 与no T组相比,CD25+组HUVECs CD86表达下降（P＜0.001）,但TW组HUVECs CD86无明显变化（P＞0.05）,表明Treg对HUVECs CD86表达的抑制作用可被Transwell小室逆转（图3A和B）。

2.4.2 与no T组相比,CD25+组HUVECs刺激T细胞增殖能力下降（P＜0.001）,但TW组HUVECs刺激T细胞增殖能力无明显变化（P＞0.05）,表明Treg对HUVECs刺激T细胞增殖能力的抑制作用可被Transwell小室逆转（图3C）。

图3 Treg对HUVECs的抑制作用依赖于细胞直接接触和细胞因子Fig.3 Tregmediated supp ression of HUVECs antigen-presenting function requires cell

3 讨论

动脉粥样硬化（AS）是一种炎症性疾病,免疫反应促进了AS病变进展[1]。传统的AS危险因素如ox-LDL能刺激内皮细胞表达各种炎性因子,吸引炎性细胞并使其在局部粘附,进而进入内膜下,产生炎症反应[5]。在这一进程中,作为兼职抗原提呈细胞的内皮细胞被炎性介质激活,并表达MHC-Ⅱ和共刺激分子提呈抗原,从而介导细胞免疫反应,为关键步骤之一[6,7]。有报道认为抗原提呈细胞（APC）的抗原力与其表面分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达量呈正相关。此外,CD86组成性地低表达于未受刺激的APC,APC活化后,CD86分子的表达先于CD80迅速上调;转染CD80的肿瘤细胞,其免疫原性明显低于转染CD86的肿瘤细胞,因而认为CD86是启动免疫应答更重要的分子[8,9]。但既往研究存在争议,有报道认为内皮细胞表面表达CD80和/或CD86[10],有报道认为不表达[11]。这种差异一般认为与细胞来源,细胞所处代数或不同的培养环境有关。本实验中,在ox-LDL刺激下,HUVECs可高表达HLA DR与CD86,而CD80在刺激前后均为低表达,提示在ox-LDL刺激下,HUVECs具有非常强的抗原提呈能力,且主要依赖于HLA DR与CD86。

他人及我们的诸多研究表明,Treg在AS炎症反应的调控中起重要作用:AS病人循环中Treg的数量和功能下调[12];过继输入Treg可以抑制小鼠动脉粥样硬化斑块的形成[13];Treg可抑制ox-LDL致损内皮细胞炎性因子如VCAM-1、MCP-1及IL-6的表达,且此过程中我们发现Treg可抑制内皮细胞CD86的表达[4]。但Treg是否可抑制内皮细胞的抗原提呈能力及可能机制,研究较少。本实验发现,HUVECs与Treg共培养24小时,HUVECs CD86表达显著被抑制,与我们既往研究相似[4]。HUVECs与不同浓度Treg共培养后,其刺激CD4+CD25-T细胞增殖的能力亦显著被抑制,说明Treg可下调内皮细胞的抗原提呈能力,抑制其介导的免疫反应,从而发挥抗AS的作用。

Treg发生免疫调节的确切机制尚存争议,有的报道认为其调节功能依赖于细胞直接接触;也有报道认为其调节功能由细胞因子介导[14]。产生这一差异的原因可能与Treg作用于不同的细胞,或与其发挥不同的效应时所依赖的机制不同有关。如本实验发现,Treg与HUVECs共培养后HUVECs CD86的表达及其刺激T细胞增殖能力明显下降;而用Transwell小室阻断Treg与HUVECs直接接触后,上述效应被完全逆转,说明Treg对HUVECs抗原提呈能力的抑制作用依赖于细胞直接接触。

综上所述,本实验表明Treg作为一种内源性免疫调节系统的调节者,可抑制ox-LDL诱导损伤的HUVECs抗原提呈分子的表达及刺激T细胞增殖的能力,从而抑制AS的发生发展。上述发现不仅有助于阐明Treg在AS发生发展中的调控作用,而且为AS的防治提供了一条新的途径。

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[收稿2010-11-27 修回2011-01-13]

（编辑 许四平）

CD4+CD25+regulatory T cellsmodulate antigen-p resenting function of human umbilical vein endothelial cells

HEShao-Lin,LIDa-Zhu,LIMing,MAXu-Ming,LINJing,CHANGWei,ZHAOHui.InstituteofCardiology,Union Hospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

Objective:To investigate whether and how Treg affect the antigen-presenting function of HUVECs,and themechanism of Treg in the developmentof atherosclerosis.Methods:Treg were isolated from human peripheral b loodmononuclear cells（PBMCs）which obtained from normal volunteers bymagnetic cell sorting-column and analyzed by Flow Cytometry.HUVECswere incubated alone（control）or with anti-CD3mAbs activated Treg（CD25+）and ox-LDL.After 24 h,HUVECswere collected and the expression of HLA DR,CD80 and CD86 weremeasured by flow cytometry.ox-LDL treated HUVECs which were pre-cultured with different concentrations of human anti-CD3 mAbs activated Treg were used to stimu late CD4+CD25-T cells,and then the effectof HUVECs on the proliferation of CD4+CD25-T cells weredetected by Cell Counting Kit-8（CCK-8）.Transwell experimentwasused to identify how Treg affect the antigen-presenting function of HUVECs.Results:Treg can significantly inhibit the expression ofantigen presentingmolecular in HUVECs aswellas theeffectof HUVECs on the proliferation of CD4+CD25-T cellswhen compared with that in control system;Mechanistic studies reveal that the expression of antigen p resentingmolecular in HUVECs and theeffectof HUVCs on the proliferation of CD4+CD25-T cells in TW system haveno differencewhen compared with that in no Tsystem.Conclusion:Treg areable tomodulate the antigen-presenting function ofHUVECs,which is largely attributed to a down-regulated expression in CD86 in Treg-treated HUVECs and depended on cell contact.

CD4+CD25+Regulatory T cells;Human umbilical vein endothelial cells;oxidized Low-Density Lipoprotein;Antigen-presentingmolecules;Cell proliferation

R392.12

A

1000-484X（2011）05-0391-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.002

①本文为国家自然基金资助项目（No.30670855）

何少林（1983年-）,男,博士,主要从事冠心病发病机理及其诊断与治疗研究,E-mail:wskg1982@yahoo.com.cn;

及指导教师:李大主（1963年-）,男,教授,博士生导师,主要从事冠心病发病机理及其诊断与治疗研究,E-mail:lidazhuhp@sohu.com。