麻风病人T细胞亚群相关免疫分子表达的调查

赵宝泉 尹格平 （济南市皮肤病防治院,济南 250001）

麻风病人T细胞亚群相关免疫分子表达的调查

赵宝泉 尹格平①（济南市皮肤病防治院,济南 250001）

很多疾病其外周血免疫学检测与分析多见报道[1,2],相比之下,麻风病由于患者数量有限,其外周血相关免疫学指标的检测相对较少。本研究对新发、复发48例经我院治疗的麻风病患者,在治疗前及第2、4周的外周血T淋巴细胞相关免疫分子进行了动态流式细胞的测定,发现治疗前后及与健康组相比均有不同变化,有一定的临床意义,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 所有患者中男性占27例,年龄35～62岁,平均48岁;女性,21例,年龄37～ 65岁,平均年龄51岁。治疗方案按卫生部印发的《麻风病联合化疗手册》的规定执行。患者主要临床表现体征以及检查结果参考如下[3]:皮损并伴有浅感觉障碍及闭汗;周围神经干或皮支神经粗大;皮损组织切片内查到麻杆菌;病理组织中见到特异性改变。健康组共计27例,年龄在30～60之间,其中男性14例,女性13例。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 流式细胞仪检测为FACScan型,由美国BD公司生产,CellQuestPlot软件由BD公司提供,淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所出品,用于免疫阴性对照的IgG1-FITC/IgG1-PE抗体、异硫氢酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD3/CD4/CD8（三色标记）、CD3/HLA-DR（双色标记）和CD3/CD16+CD56+（双色标记）均由美国Pharmingen产品,北京岳泰公司提供。

1.2.2 取样方法 所有麻风病患者于治疗前抽取肘静脉血2m l,选取2%的EDTA（乙二胺四己酸）1∶9抗凝;于治疗后第2周及4周再抽肘静脉血2ml,同上法抗凝,另取27例健康组的外周血作对照,取样同上。

1.2.3 提取外周血淋巴细胞（PBL） 将2ml经过抗凝的静脉血放于10ml试管,加入2 ml淋巴细胞分离液,以1 500 r/min的速度离心10分钟,提取其淋巴细胞层,再以2 ml磷酸缓冲液（PBS）漂洗,同速离心2次,弃去上清液,然后将细胞悬液分入2支5 ml试管中,调整细胞数至106m l-1,备用[4]。

1.2.4 荧光单克隆抗体免疫标记淋巴细胞的方法于 3支试管中各加500μl PBL,加20μl相应的单克隆抗体 CD3/CD16+CD56+、CD3/CD4/CD8和CD3/HLA-DR工作液;另一支试管加20μl阴性对照抗体 IgG1-FITC/IgG1-PE,均避光反应 20分钟,以2 000 r/min转速离心15分钟,磷酸缓冲液2 m l漂洗,再同速离心漂洗1次,弃去上清液,最后加入PBS 500μl待测。

1.2.5 流式细胞仪检测方法 上样前先以标准荧光微球调整仪器的变异系数并将其稳定在2%以内,上样后收集2万个细胞,光散射数据存入软盘,荧光强度以对数形式放大,测试完后于Macintosh650计算机上用CellQuest Plot软件分析数据,最后用HP1200c/PC打印结果。

1.2.6 检测项目 上样后记数辅助和诱导T淋巴细胞（CD3+/CD4+）、辅助和诱导与细胞毒抑制T淋巴细胞比值（CD4/CD8）、CD3+/HLA-DR、CD3+/CD16+CD56+、NK（CD3-/CD16+CD56+）、静止 性 T 细胞（CD3+/HLA-DR-）、活化 T淋巴细胞（CD3+/HLADR+和CD3+/CD16+CD56+）。健康组及患病组检测值均以 ¯x±s形式表示,所得数据采用t检验。

2 结果

2.1 健康组外周血淋巴细胞亚群CD3/CD4/CD8、CD3/HLA-DR、CD3/CD16+CD56+和 CD4/CD8比值测定结果见表1。

本组健康组男性CD3+/CD4+变化范围26.59%～42.26%、CD3+/CD8+变化范围20.02%～28.98%、CD3+/CD（l6+56）+在0.75%～1.55%、CD3+/HLADR+在0.65%～1.73%、NK在1.74%～4.56%、CD3+/HLA-DR-在 47.14%～ 58.64%、CD4/CD8比值变化范围1.23～1.84之间。女性CD3+/CD4+变化范围27.10%～41.52%、CD3+/CD8+变化范围20.56%～27.67%、CD3+/CD16+CD56+在0.59%～1.69%、CD3+/HLA-DR+在 0.72%～ 1.77%、NK 在2.11%～4.71%、CD3+/HLA-DR-在 47.85%～58.08%、CD4/CD8比值变化范围1.29～1.76之间。t检验证实健康组男女性各淋巴细胞亚群之间均无显著差异（P＜0.05）。

2.2 麻风患者外周血淋巴细胞亚群CD3/CD4/CD8、CD3/CD16+CD56+、CD3/HLA-DR 和 CD4/CD8比值测定结果,见表2。

统计学表明本组患者治疗前外周血淋巴细胞亚群中 CD3+/CD4+、NK、CD3+/HLA-DR-检测值和CD4/CD8比值均分别低于健康组相应参数,经检验有统计学意义（P＜0.05）,活化T淋巴细胞CD3+/CD16+CD56+和CD3+/HLA-DR+检测值分别高于健康组相应参数,有统计学意义 （P＜0.05）,CD3+/CD8+的检测值较健康组低,但经检验无统计学意义（P＞0.05）。48例患者在治疗后的第2周CD3+/CD4+、NK 、CD3+/HIA-DR-检测值和CD4/CD8比值分别有所提高,CD3+/CD16+CD56+和CD3+/HLADR+稍有下降或变化不明显;第4周时与健康组相比较上述免疫指标已接近正常水平（P＞0.05）。

3 讨论

目前,有关麻风病患者治疗过程中外周血淋巴细胞相关免疫分子动态测定的报道较少。由于辅助和诱导T淋巴细胞CD3+/CD4+细胞是机体的重要免疫细胞,在抗病毒感染的反应中起到了重要作用。CD3存在于成熟T淋巴细胞膜上,为该细胞的主要标志。一般情况下,CD3+/CD4+与细胞毒抑制T淋巴细胞（CD8）之间相互影响相互制约,CD4/CD8比值的变化在限定范围内,维持着免疫功能的稳定,如果此比值过高,则提示免疫功能过强,反之提示免疫功能过低。CD3/HLA-DR属于HLAⅡ类抗原,它主要存在于外周血B淋巴细胞、激活的T淋巴细胞及单核巨噬细胞上[5]。器官移植后干扰素γ（IFN-γ）、Ⅱ类抗体原表达增加也能诱导Ⅱ类抗原表达。CD3/CD16+CD56+抗原主要表达于自然杀伤细胞,该细胞群主要表达 CD16、CD57和 D65,其中以CD16+CD56+活性最强,可达90%以上,主要参与细胞毒抑制T淋巴细胞亚群、NK细胞反应。

目前,联合化疗仍为麻风病治疗的首选方案,联合化疗复发率明显低于DDS单独治疗。通过研究发现男、女性患者治疗前外周血淋巴细胞亚群中NK、CD3+/CD4+、CD3+/HLA-DR-检测值和 CD4/CD8比值均分别低于健康组相应值,CD3+/CD8+的检测值较健康组低,但差异无统计学意义。所有患者在治疗2周NK 、CD3+/CD4+、CD3+/HLA-DR-检测值和CD4/CD8比值均分别有所提高,CD3+/CD（16+65）+和CD3+/HLA-DR+稍有下降或变化不明显,CD3+/CD8+的检测值稍有增高;第4周时上述免疫指标已接近正常水平。通过本研究发现大部分例患者治疗前外周血淋巴细胞亚群及活化T淋巴细胞的检测值异常,治疗2周明显改善,第4周上述免疫指标已接近正常水平,为联合化疗后机体免疫功能恢复的结果,患者早期病情波动,机体免疫功能较低,晚期波动时机体免疫功能变化不明显,与化疗时间有关。本研究证明麻风病与机体免疫功能密切相关,免疫检测值增高提示预后较好,检测值低则预后差。上述结果有助临床判断病情预后,有重要的临床意义。

表1 健康组外周血淋巴细胞亚群测定结果（±s）Tab.1 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in the healthy group（±s）

表1 健康组外周血淋巴细胞亚群测定结果（±s）Tab.1 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in the healthy group（±s）

Sex CD4+ CD8+ CD 3+/CD（16+56）+ NK CD3+/HLA-DR-CD3+/HLA-DR+ CD4/CD8 Male 34.21±6.53 23.91±3.42 1.16±0.35 3.13±1.30 52.83±4.41 1.20±0.41 1.55±0.26 Female 33.98±5.81 24.31±3.12 1.12±0.48 3.21±1.12 53.33±4.55 1.23±0.45 1.51±0.19

表2 麻风患者外周血淋巴细胞亚群测定结果（±s）Tab.2 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in lep rosy patients（±s）

表2 麻风患者外周血淋巴细胞亚群测定结果（±s）Tab.2 Assay of peripheral lymphocytes（PBL）subsets in lep rosy patients（±s）

Note:There was significant difference between experimental group and controlgroup.

Text time CD4+ CD8+ CD 3+/CD（16+56）+ NK CD3+/HLA-DR-CD3+/HLA-DR+ CD4/CD8 Male（n1=27）Before treatment 25.72±8.74 18.65±8.24 4.20±2.65 1.21±0.74 41.22±4.31 3.15±2.53 0.95±0.39 Twoweeksafter treatment 28.81±9.22 19.45±7.68 3.56±2.63 3.44±1.64 48.32±9.98 2.55±1.54 1.02±0.43 Fourweeksafter treatment 31.31±5.64 22.11±4.51 2.20±1.35 3.16±1.56 50.13±5.64 2.00±0.55 11.24±0.27 Female（n2=21）Before treatment 25.36±7.58 18.68±7.66 5.64±2.68 1.31±0.64 40.14±3.51 3.36±2.78 0.86±0.56 Twoweeksafter treatment 27.61±8.76 19.77±7.36 3.786±2.43 3.68±1.22 48.52±9.97 2.65±1.78 1.23±0.57 Fourweeksafter treatment 32.17±5.44 23.51±4.34 2.21±1.54 3.24±1.20 51.32±4.42 2.12±0.61 1.23±0.51

1 Jackson P A,GreenM A,Mark CGetal.Lymphocyte subsets in infiltration patterns and HLA antigen status in Colorectal carcinomas and adenomas[J].Gut,1996;38:85-89.

2 李香铁,李慎勤,刘少鸽etal.肾移植术后测定外周血CD3/HLADR、CD3/CD16+CD56+的临床意义[J].中华器官移植杂志,1999;20（1）:27-29.

3 陈 洪.皮肤性病学[M].第4版.北京:人民卫生出版社,1997:81-81.

4 尹格平,陈诵芬,孙晓明etal.卵巢癌组织及外周血淋巴细胞多药基因（MDR）表达蛋白的定量研究[J].中华妇产科杂志,1998;5（33）:287-289.

5 宋 强,宋素芹,赵川莉etal.再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞HLA-DR抗原的表达[J].上海免疫学杂志,1995;15:285-293.

[收稿2010-12-20 修回2011-01-25]

（编辑 张晓舟）

R755

A

1000-484X（2011）05-0466-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.020

①济南军区总医院流式细胞研究室,济南250023

赵宝泉（1960年-）,男,本科,副主任医师,主要从事麻风病方面的研究。

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