芍药苷对急性缺氧前扣带回锥体神经元的影响*

李 果 杜永平△ 张月萍 徐 晖 胡三觉

1第四军医大学西京医院（陕西西安710032）

2第四军医大学神经生物研究所（陕西西安710032）

急性缺氧引起的脑损伤多发生于窒息、中风等脑疾病过程中，是导致运动功能障碍和智力低下的关键因素。芍药苷是中药芍药的主要有效单体成分，既往的研究表明其具有降低血液黏度、扩张血管、抗氧化、改善微循环等作用；能通过抑制细胞内钙超载，阻断钠通道，抑制细胞凋亡，抗兴奋性氨基酸毒性［1-4］，发挥神经保护作用。但芍药苷能否通过对突触活动的调节作用，减少神经元的凋亡，目前尚未见报道。本实验采用急性缺氧离体脑片，利用全细胞膜片钳技术探讨芍药苷对神经元微小兴奋性突触后电流（mEPSC）的作用，为其神经保护作用进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康SD大鼠，雄性，体质量90～120g，鼠龄 4～6周，由第四军医大学实验动物中心提供。记录电极（硬质玻璃毛坯，南京泉水教学实验器材厂）；氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）、氯化钙（CaCl2）、氯化镁 （MgCl2）、 氢 氧 化 钾 （KOH）、 硫 酸 镁 （MgSO4·7H2O）、 葡 萄 糖（glucose）、葡萄糖酸钾（K-gluconate）均购自天津市医药公司，EGTA、HEPES、Mg-ATP、Phosphoreatine disodium、Na3-GTP、TTX、CNQX 和MK-801为Sigma公司产品；芍药苷（标准品，中国药品生物制品检定所提供）。

1.2 实验仪器 振动切片机（Vibratome series1000plus，美国）；恒流泵（HL-2，上海泸西仪器厂）；垂直拉制仪（PP-83型，日本Narishige Instruments）；正置显微镜（Olympus，Bx51wI，日本）。

1.3 溶液的配制 按文献［5］报道方法配制细胞外液和内液。细胞外液（人工脑脊液，ACSF），成分：124mmol/L NaCl、2.5mmol/L KCl、2mmol/L CaCl2、2mmol/L MgSO4·7H2O、25mmol/L NaHCO3、1mmol/L NaH2PO4、10mmol/L glucose，pH 为 7.4， 渗透压为 300～310mOsm/L。 电极内液：120mmol/L K-gluconate、5mmol/L NaCl、1mmol/L MgCl2、0.2mmol/L EGTA、10mmol/L HEPES、2mmol/L Mg-ATP、0.1mmol/L Na3-GTP、10mmol/L Phosphoreatine disodium， 用KOH调pH为7.2左右，渗透压为295～310mOsm/L。

1.4 方法 （1）脑片的制备：用戊巴比妥钠（0.5mL/100g）腹腔注射麻醉，大鼠断头后迅速取出脑组织块，置于含饱和95%O2、5%CO2的0℃ACSF中，大约1min后取出。用滤纸吸干粘贴面液体，迅速移入切片槽内粘贴，并用一个3%琼脂块固定。然后迅速向切片槽内倒入0℃ACSF，切片过程中不断通入含95%O2、5%CO2的混合气体。用振动切片机切出含有前扣带回在内的300μm冠状脑片，切好的脑片立即置于含ACSF湿润的滤纸上贴附式孵育 30min（26~28℃）［6］，然后将孵育槽转移至室温下孵育大约1h开始记录，整个过程持续通95%O2、5%CO2的混合气体。（2）脑片的固定和灌流：将脑片移到浴槽内，用U型铂金丝固定。使用恒流泵持续向装有脑片的浴槽内灌注含95%O2、5%CO2饱和气体的 ACSF，流速为 1～1.5mL/min。所有的记录在室温（22～24℃）下进行。（3）全细胞膜片钳记录：实验记录电极用垂直拉制仪分两步制成，电极电阻为4～8MΩ。实验在正置显微镜下进行，用5×物镜定位，40×物镜观察细胞状态并进行可视封接。将灌有电极内液的玻璃微电极安置在电极夹持器上，并施加一个微小的正压，以防电极尖端入液后堵塞。当充灌电极内液的电极尖端轻轻接触细胞膜表面形成一个小凹后释放正压，并轻施负压吸引细胞膜，同时将钳制电压调至-70mV。当电极尖端与细胞膜之间形成大于0.1MΩ的高阻抗时，即认为封接成功。高阻封接后给予轻柔短促的吸吮或电击（Zap）破膜，以形成全细胞膜记录模式。在全细胞膜记录模式下，通含95%O2、5%CO2饱和气体的ACSF，待稳定后记录正常的 mEPSC 5～6min； 利用灌流泵再通含 95%N2、5%CO2饱和气体的 ACSF，造成急性缺氧模型［7］，继续记录 5～6min；最后转换含有芍药苷 （300μmol/L）的正常ACSF进行加药，记录5~6min。 在整个记录过程中 ACSF中加有TTX（1μmol/L）、CNQX（10μmol/L）和 MK-801（10umol/L）。 在电压钳模式下静息膜电位小于-50mV，或在电流钳模式下漏流＞100pA，或串联电阻＞30MΩ，记录都将终止。（4）数据的采集分析和统计学处理：实验中所有的电刺激均从胞体内给予，模拟-数字转换器（Digidata1322A，Axon Instruments）采样频率 10kHz，低通滤波频率为1kHz；数据采集、记录采用Axon实验室提供的软件包Clampex8.1进行，分析软件采用Clampfit 8.1与Mini anylsis，绘图软件采用Origin 6.1和Coredraw X3。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。所用数据以表示，显著性检验采用one-way ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 红外可视条件下ACC锥体细胞的形态学特征 在倒置显微镜下，可以清楚的看到300μm脑片上所记录的ACC区域（图1A）。该区锥体细胞排列整齐，胞体呈锥体或三角形，边界清楚，核仁清晰（图1B）。直径为15~20μm，锥体尖朝向皮质表面，发出顶树突，垂直行向脑表面。

2.2 ACC锥体神经元的电生理特征 见表1、图2。依据神经元的电生理及动作电位特征，判定所记录的ACC锥体神经元。所记录神经元的典型放电特征是单个动作电位后伴随一个明显的后超极化［5］。

2.3 急性缺氧对ACC锥体神经元的影响 急性缺氧后ACC锥体神经元的mEPSC个数及幅度比正常状态下增加 （图 3），mEPSC 的频率从正常时 （3.31±0.06）Hz增加到 （3.85±0.06）Hz（n=10，P＜0.01），呈递增趋势（图 4）。

表1 ACC锥体神经元的电生理特性

表1 ACC锥体神经元的电生理特性

?

图1 SD大鼠ACC区域记录锥体神经元形态

图2 ACC锥体神经元的放电模式

图3 不同条件下ACC锥体神经元的mEPSC

图4 不同条件对ACC锥体神经元mEPSC个数及频率的影响

2.4 芍药苷对急性缺氧ACC锥体神经元的作用 急性缺氧5~6min后，灌流含有芍药苷（300μmol/L）的正常 ACSF，ACC 锥体神经元的mEPSC个数及幅度比急性缺氧后减少（图3），mEPSC的频率从（3.85±0.06）Hz 减少为（3.07±0.06）Hz（n=10，P＜0.05），呈递减趋势（图4）。

3 讨 论

急性缺氧性脑损伤是由于急性缺氧引发的脑组织代谢功障碍，进而导致弥漫性脑部损害及一系列神经精神异常的临床综合征。缺氧的持续时间、严重程度、就诊时间等不同，导致临床症状的严重程度及愈后也不同。脑组织的代谢活动主要依靠有氧糖代谢，对缺氧十分敏感，因此严重缺氧或治疗不及时可导致局部脑神经元的坏死、凋亡等不可逆损害。由于脑组织的血流量分布不均衡，不同部位对缺氧的敏感性亦不同，大脑皮质、海马神经元最敏感，其次为纹状体和小脑［8］。前扣带回属于大脑皮质的原皮质和旧皮质部分，具有重要的情感调节和高等认知（学习、记忆等）作用，被认为是执行功能的神经基础［9-10］。脑缺氧时大量兴奋性氨基酸，尤其是谷氨酸的暴发性释放，导致突触间隙内谷氨酸的含量急剧升高。突触后膜上的谷氨酸受体过度激活，钙离子大量内流促进突触小泡内神经递质的释放，引起mEPSC的频率增加。本实验应用膜片钳技术，记录急性缺氧后离体脑片ACC锥体神经元的mEPSC，发现急性缺氧导致神经元的mEPSC频率显著增加，这与在海马CA1区记录的结果一致［7］。

芍药性微寒、味苦酸，《神农本草经》记载“主邪气腹痛，除血痹，破坚积寒热，疝瘕，止痛，利小便，益气”。芍药有白芍和赤芍之分，白芍养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳，赤芍清热凉血、散瘀止痛。两者作用虽然不同，但主要化学成分都为芍药苷。有研究表明，芍药苷能迅速渗透血脑屏障，达到大脑各个区域［11］，这为芍药苷应用于急性缺氧性脑损伤的治疗提供了前提。芍药苷是中药芍药中主要的生物活性提取物，具有多种药理活性。本实验研究发现急性缺氧后，通过灌流给予含有芍药苷的正常ACSF，神经元的mEPSC频率显著减少。可能机制是：芍药苷通过抑制细胞内钙离子内流，减少突触小泡内神经递质的过度释放，降低突触活动的兴奋性，而发挥神经保护作用。

本研究表明，芍药苷可减少急性缺氧后ACC锥体神经元mEPSC的频率，并首次提出了芍药苷可能参与了突触活动可塑性的调节，这一结果进一步证实了芍药苷具有神经保护作用。

［1］杨军，何丽娜，何素冰.芍药苷对氯化钾及N-甲基-D-门冬氨酶诱导诱导的PC12细胞钙超载损伤的保护作用 ［J］.中国新药杂志，2001，10（6）：426.

［2］ Zhang GQ，Hao X M，Chen SZ，et al.Lockade of paeoniflorin on sodium current in mouse hippocampal CA1neurons［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24 （12） ：1248.

［3］孙蓉，武栋栋，刘国卿.一氧化氮诱导PC12细胞凋亡及芍药苷的保护作用 ［J］.中国临床药理学与治疗学，2005，10 （11） ：1266.

［4］吴玉梅，许汉鹏，王春婷，等.芍药苷对培养小鼠皮层神经元的保护作用 ［ J］.中国药理学与毒理学杂志，2002，16 （3） ：172.

［5］ XiaoY C，Hui X，Long JW，et al.Characterization of intrinsic properties of cingulate pyramidal neurons in adult mice after nerve injury ［J］.Molecular Pain，2009，5（1）：73

［6］ ZHANGY，GUOEC.Time-dependent changes in learning ability and induction of long-term potentiation in the lithium–pilocarpine-induced epileptic mousemodel［J］.Epilepsy&Behavior，2010（17）：448-454.

［7］ Katchman A N，Hershkowitz N.Early anoxia-induced vesicular glutamate release results from mobilization of calcium from intracellular stores［J］.JNeurophysiol，1993 ，70（1）：1-7.

［8］ 王维治.神经病学［M］.4 版．北京：人民卫生出版社，2001：122-125.

［9］ Osaka M，Osaka N，Kondo H，et al．The neural basis of individual differences in working memory capacity：an fMRI study ［J］.Neuroimage，2003，18（6）：789-797．

［10］ Smith EE，Jonides J．Storage and executive processes in the frontal lobes［J］.Science，1999，283（15）：1657-1661．

［11］杜力军，刘瑞凝，王雪莉，等.脑核团分布运动力学在研究脑功能调节中药中的作用［J］.世界科学技术：中医药现代化，2006，8（3）：14-18.