脂脉宁对酒精性脂肪肝大鼠血清和肝组织SOD活性及MDA含量的影响*

解庆凡 王建华 王晓贞 郭文平 张一昕

1河北省邢台市人民医院（河北邢台054031）

2河北医科大学中医学院（河北石家庄050000）

脂脉宁为本课题组自行研制的治疗酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）的中药制剂，经多年临床运用证实，疗效确切［1］。据报道，氧应激与脂质过氧化损伤是AFL形成和发展的一个重要因素［2］。为了探讨脂脉宁的作用机理，笔者观察了其对AFL模型大鼠血清和肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影响。

1 材 料

1.1 动物 健康wistar大鼠70只，雄性，清洁级，体质量160～180g，购自河北省实验动物中心（合格证号：1003046）。

1.2 药物 脂脉宁胶囊：泽泻、姜黄、山楂、石菖蒲、白术、皂角刺、大黄、何首乌等；由笔者所在医院制剂室制备，实验时用蒸馏水配制成所需浓度。东宝肝泰片为通化东宝药业股份有限公司出品，批号为H22024764；实验时用0.5%的羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液。

1.3 试剂 天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）试剂盒均由北京中生生物工程高技术公司提供；SOD试剂盒、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；胆固醇、胆盐均购自北京奥博星生物技术责任有限公司；体积分数56%红星二锅头白酒（北京红星二锅头酒厂生产）。

1.4 主要仪器 半自动生化分析仪（德国毫迈克公司）、722型光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、MSE-25型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、LAUDA-C3型循环恒温水浴箱（泰克仪器有限公司）、日本日立H-7500型透射电子显微镜。

2 方 法

2.1 动物分组 将大鼠饲养于18～22℃明暗各12h的清洁级动物实验室内。正常喂养1周后，按体质量随机分为5组：正常组、模型组、脂脉宁高、低剂量组、东宝肝泰对照组。除正常组10只外，其余各组均为15只大鼠。

2.2 造模与给药 正常组用蒸馏水灌胃，进食普通饲料，自由饮水。其余各组参照文献［3-4］造模：用体积分数56%红星二锅头灌胃，体积分数从30%逐渐升至56%，梯度为每周升高5%，于第6周直接升至56%，并持续至第8周，同时喂饲高脂饲料（由1.5%胆固醇、0.5%胆盐、10%猪油和88%基础饲料制成），自由饮水。大鼠造模的同时各组分别给予相应药物灌胃，给药剂量按药理实验方法学计算，脂脉宁高、低剂量组分别按2.0、1.0g/kg灌服脂脉宁，对照组按0.9g/kg灌服东宝甘泰片，正常组和模型组灌服蒸馏水，1次/d，每次用药体积均按1mL/100g计算，持续8周。

2.3 标本处理 实验8周末，于最后1次给药后禁食12h。各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，低温离心，分离血清，密封，-20℃冷存待检。取血后迅速剖取肝脏，在肝脏最大叶距边缘0.5cm处取0.5cm×0.5cm大小肝组织，用4%的多聚甲醛固定。另取适量肝组织用冰生理盐水冲洗，滤纸吸湿后，称取湿质量约0.3g，加入预冷的生理盐水，冰水中制成10%匀浆，4℃4000r/min离心10min，提取上清液，-20℃冷存待检。

2.4 检测指标 肝组织病理形态学观察：取用4%多聚甲醛固定的肝组织，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。血脂和肝功能检测：取血清在半自动生化分析仪上测定TC、TG、AST、ALT的含量或活性。血清和肝组织SOD和MDA的测定：SOD的检测采用黄嘌呤氧化酶法、MDA的检测采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法，严格按试剂盒说明书检测。

2.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。数据以表示，采用方差分析、Student-Newman-Keul检验。血清中SOD活性=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度/50%×反应液总体积/取样量）/组织中蛋白含量；组织中SOD活性=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度/5%×（反应液总体积/取样量）/组织中蛋白含量。血清中MDA含量=（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度×样品测试前的稀释倍数；组织中MDA含量=（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度/蛋白含量。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠肝脏病理形态学变化比较 肉眼可见：正常组肝脏外观呈红褐色，柔软富有弹性；模型组肝脏体积增大，边缘钝而厚，表面及切面呈灰黄色，油腻感；各用药组之间肉眼观察差别不明显，色泽较暗，质地、弹性均介于模型组与正常组之间。HE染色后光镜下观察：正常组大鼠肝小叶结构正常，中央静脉大而壁薄，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形，无浊肿、坏死，胞浆无脂滴，无炎性细胞浸润。模型组大鼠肝小叶结构不清，肝细胞索紊乱，肝窦变窄，多数肝细胞浊肿、明显脂肪变性，脂滴以大泡型为主，可见点状坏死和炎性细胞浸润。各治疗组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞脂肪变性明显好转，肝细胞排列整齐，肝窦基本恢复正常，少量肝细胞浊肿，无炎性细胞浸润和坏死。

3.2 各组大鼠血清TC、TG、ALT、AST水平比较 见表1。与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量异常升高（P＜0.01），显示AFL大鼠存在着明显的血脂代谢紊乱和肝功能异常。给药后，脂脉宁高、低剂量组和东宝肝泰对照组均能显著降低实验大鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。其中，脂脉宁高剂量组改善优于东宝肝泰对照组（P＜0.05或0.01）。

表1 各组大鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比较

表1 各组大鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比较

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜ 0.01；与东宝肝泰对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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3.3 各组大鼠血清和肝组织SOD活性和MDA含量比较 见表2。与正常组比较，模型组大鼠血清、肝组织中SOD活性均较正常组明显降低（P＜0.05）、MDA含量均较正常组升高（P＜0.05或0.01）。各治疗组大鼠血清、肝组织中SOD活性均高于模型组、MDA含量均低于模型组（P＜0.05或0.01）。脂脉宁高、低剂量组血清、肝组织中SOD含量均高于东宝肝泰对照组，MDA含量均低于东宝肝泰对照组（P＜0.05或0.01）。

表2 各组大鼠血清和肝组织SOD活性和MDA含量的比较

表2 各组大鼠血清和肝组织SOD活性和MDA含量的比较

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4 讨 论

AFL在中医学中无独立的病名，根据其病因、病机及临床表现，可归属于中医学 “酒疸”、“胁痛”、“伤酒”、“酒癖”、“酒胀”、“酒劳”、“积聚”等范畴。中医学认为酒为湿热有毒之邪气，味甘，苦辛，性温，有毒；入心、肝、脾、胃经。过量饮用则酒毒湿热蕴结于中焦，损伤脾胃，湿浊内生，聚湿生痰，痰阻气滞，肝失疏泄，气滞血瘀，痰湿瘀毒相搏，结于胁下而成此病。病情缠绵不愈，日久则耗伤肝肾之阴。因此湿热痰瘀互结，肝脾失调为AFL的主要病机，故脂脉宁选用泽泻利湿消痰、泄热；皂角刺祛痰散结；姜黄、山楂疏肝行气、祛瘀通络；石菖蒲、白术祛湿健脾；大黄通腑导滞，排除湿毒瘀积；何首乌补肝肾、益精血。诸药合用，共奏祛湿泄热、疏肝活血、健脾益肾之功。

SOD能够清除氧阴离子自由基，保护细胞，间接反映了机体清除氧自由基的能力；MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物的一种，其量的变化常常反映体内脂质过氧化的程度，也间接地反映了细胞损伤的程度。这两个指标反映了体内自由基的氧化和抗自由基的水平。关于AFL的发病机理目前尚不清楚，近年来有人提出以氧应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”假说［2］，国内外学者普遍认为细胞色素P450ⅡE1（CYP2E1）在酒精代谢过程中产生的氧自由基是造成AFL肝损伤的重要环节［5］。研究发现AFL肝脏中抗氧化物质明显减少，氧自由基和脂质过氧化产物MDA含量明显增高，自由基可与生物膜的含3个或3个以上双键的脂肪酰脂质发生加氧反应产生MDA；MDA的两个功能基又可与线粒体的膜质、膜蛋白NH2交联形成西夫氏碱增加了膜的刚性，影响线粒体膜中酶的活性，导致线粒体功能异常，干扰脂肪酸β氧化，ATP生成减少，导致脂肪在肝脏沉积［6］。因此抑制氧化应激反应，增强细胞膜稳定性，减少脂质过氧化产物的形成将有助于改善酒精性肝病肝脏损伤。

本研究显示，模型组大鼠血清中 TC、TG、AST、ALT、MDA 和肝组织中MDA的含量明显升高，血清和肝组织中SOD含量明显降低，镜下可见肝小叶结构紊乱，肝细胞索紊乱，肝细胞呈大泡样脂肪变性，可见坏死灶和炎性细胞浸润。经过药物治疗后，血清中TC、TG、AST、ALT、MDA和肝组织中MDA的含量明显降低，血清和肝组织中SOD含量明显升高，肝脏组织结构明显改善。提示脂脉宁通过增强肝脏抗氧化能力，清除自由基，减轻脂质过氧化反应，以达到抗AFL的作用。此可能是脂脉宁治疗AFL的作用机制之一。

［1］ 王晓贞.脂脉宁治疗酒精性脂肪肝临床疗效观察［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12（2）：60-61.

［2］ Savas MC，Koruk M，Pirim I，et al.Serum ubiquitin levels in patients with nonalcoholic steatohepatitis ［J］.Hepatogastroenterology，2003，50（51）：738-741

［3］ 古赛，蒋小黎，何琳，等.大鼠慢性酒精性脂肪肝模型的建立［J］.重庆医科大学学报，2006，31（1）：81.

［4］朱卫丰，赵益，许可冀，等.东宝肝泰片防治大鼠酒精性脂肪肝的作用及机制研究［J］ .中国药房，2009，20（28）：2179-2181.

［5］ Morgan K，French SW，Morgan T R.Production of acytochrome P450 2E1 transgenic mouse and initial eval-uation of alcoholic liver damage［J］.Hepatology，2002，36（1）：122-134.

［6］ Sampey B P，Korourian S，Ronis M J，et al.Immuno-histochemical characterization of hepatic malondialde-hyde and 4-hydroxynonenal modified protein during early stages of ethanol-induced liver injury［J］.Alcohol Clin Exp Res，2003，27 （6）：1015-1022.