骨保护素的生物学特性及其在口腔领域的研究进展*

苏 方 刘世森 刘洪臣

骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是 1997年Simonet等[1]发现的一种能阻止破骨细胞分化，促进骨形成的关键因子。骨保护素及其配体核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)，阐明了破骨细胞发育、分化及骨吸收—重建的分子机制。破骨细胞增殖、分化、成熟的信号传导途径有2个：主要途径是OPG/RANKL/RANK通路；次要途径是IL-1，TNF-α等炎症因子的非RANKL/RANK依赖途径，2个途径之间有着密切联系；OPG在破骨细胞的发生、分化发育过程中起核心作用，它可作为诱饵受体与RANKL结合，从而达到抑制破骨细胞成熟与激活作用[2,3]。

OPG为肿瘤坏死因子受体超家族成员，属于一种可溶性糖蛋白，是RANKL的天然诱饵受体，主要由成骨细胞-基质细胞表达。RANKL则是TNF配体超家族成员，是成骨细胞分泌的膜蛋白，它能与位于破骨细胞表面惟一的受体—核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB,RANK)结合，通过一系列酶促级联反应引起破骨细胞的活化。由于OPG能竞争性地与RANKL结合，阻断RANK与RANKL间的相互作用，从而抑制破骨细胞的形成和活化，OPG/RANKL/RANK成为破骨细胞活化的分子基础，OPG/RANKL比例的变化影响着破骨细胞的形成和活化，许多因素正是通过调节这一对因子而发挥作用[4,5]。

骨吸收的研究是口腔医学中的一个重要课题，随着对破骨细胞调节机制研究的突破，研究者开始对OPG和RANKL在口腔骨组织吸收中的作用进行研究。OPG作为骨保护因子在牙周炎、正畸性牙移动、牙萌出中的作用日益引起重视，本文就OPG在口腔领域的研究进展做一综述。

1.OPG在牙周炎中的研究进展

牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，占成人失牙原因的40%，主要表现为牙周支持组织尤其是牙槽骨的吸收破坏。牙槽骨吸收破坏的病理过程与全身其他部位的骨吸收破坏是完全相同的，都是由破骨细胞局部活化，功能亢进引起，仍受到OPG/RANKL/RANK这一重要信号传导通路的影响。在牙槽骨破坏过程中，OPG/RANKL的表达平衡被打破。

牙周组织中最重要的一种细胞是牙周膜细胞(Periodontal ligament cells,PDLCs)，[6]有学者研究发现[7-9]，PDLCs存在OPG和RANKL两种细胞因子，在没有受到外界刺激时牙周膜细胞OPG表达较RANKL明显强，不利于破骨生成，以维持牙周内环境的稳定。揭示了PDLCs是通过OPG/RANKL系统来调节牙槽骨代谢的。由于PDLCs位于牙槽骨和牙骨质之间，其分泌的OPG可能在抵御炎症组织中RANKL介导的骨吸收中发挥一定的防御功能。Kanzaki等[10]通过建立牙周膜细胞和外周血单核细胞的共同培养体系，发现共同培养体系中的牙周膜细胞可通过改变OPG和RANKL的表达，从而诱导破骨细胞形成，这表明OPG和RANKL与牙齿和牙槽骨的吸收关系密切。Hasegawa等[11]研究发现体外培养PDLCs能够产生OPG、RANKL，且OPG的量大于RANKL。与骨髓细胞共培养，无TRAP(+)MNC形成。只有当同时加入1,25-(OH)2D3/Dex和抗OPG抗体时，能诱导大量的TRAP(+)MNC产生，且这些TRAP(+)MNC具有骨吸收活性。说明PDLCs产生的OPG能够抑制自身产生的RANKL，只有当OPG被抗OPG抗体完全中和后,PDLCs产生的RANKL才能发挥作用。

研究发现，在牙槽骨破坏过程中，OPG/RANKL的表达平衡被打破。Cortti等[12]对牙周病患者牙槽骨吸收部位肉芽组织或牙龈中RANKL与OPG表达进行分析，发现牙周病患者的RANKL表达高于非牙周病患者，而OPG表达则降低，同时发现内皮细胞OPG表达阳性，胸腺依赖性细胞及巨噬细胞RANKL表达阳性。Liu等[13]对进展期和稳定期牙周炎的牙龈与正常牙龈进行比较，发现进展期牙周炎的牙龈RANKL mRNA表达最强，OPG mRNA在牙周炎进展期和稳定期的量比正常牙龈低，证明RANKL和OPG的表达强弱与牙槽骨破坏速度有直接联系。Mogi等[14]测量不同程度牙周病患者龈沟液中RANK L和OPG的表达时发现，RANKL浓度增高，OPG浓度降低。Valverde[15]等在诱发实验性牙周炎实验中，观察到牙周局部RANKL表达增高，牙槽骨吸收，局部注射OPG后阻断此效应，且RANKL/OPG之比降低90%，表明RANKL/OPG之比的升高是牙槽骨吸收的关键因素。

细菌产生的毒素或组织表达的炎症介质也是通过影响牙周膜细胞增高或者减少OPG的表达而影响组织修复的。有学者尝试通过增加牙周组织中OPG分泌而抑制RANKL表达，阻断破骨细胞增殖，分化与成熟，从而治疗因牙周病而引起的牙槽骨丧失。Shiba等[16]首次发现OPG的表达、增殖能力与人牙周膜细胞增龄改变之间存在一定联系，增加OPG抑制RANKL的表达是治疗牙周炎，减少骨损失及牙脱落的有效手段。Jin等[17]将OPG-Fc皮下注射到牙周炎老鼠体内后第3～6周鼠的牙槽骨量明显增多，从而证实OPG治疗牙周病有效。Chen等[18]通过在大鼠磨牙腭侧注射脂多糖，诱导大鼠牙周骨丧失模型，以质粒转染OPG基因到失活 HVJ(hemagglutinating—virus of Japan，HVJ)中，局部注射到大鼠磨牙的牙周组织，发现OPG表达增高,RANKL介导的破骨细胞发生受到抑制，认为局部OPG基因转染能有效减少牙槽骨吸收。

在中年人，特别是绝经后女性中牙周病的发病率较高。大量的临床和动物实验证实，绝经后女性骨质疏松症与牙周病有一定的相关性，全身骨质疏松程度与颌骨的骨矿丢失也有显著相关性，雌激素治疗可提高牙槽骨密度[19-21]。随着OPG在防治骨质疏松症的深入研究，一些OPG基因疗法和蛋白疗法除了能够有效对抗绝经后骨质疏松，同时也能有效缓解患者牙槽骨吸收，为绝经后女性牙周病的防治提供了新的思路。

2.OPG在正畸牙移动中的研究进展

机械力作用下引起的牙槽骨改建是口腔正畸的生理基础。在正畸牙的移动中，牙周组织中的OPG和RANKL在调整牙槽骨吸收平衡中是重要的决定因素[22]。Shiotani等[23]研究发现，当周围血单核细胞与牙周韧带细胞共同培养时，对牙本质薄片产生更多的破骨陷窝；牙周膜细胞表达了RANKL、OPG的mRNA，它能通过双向机制刺激RANKL的活性及抑制OPG来调节破骨细胞形成，从而影响牙周炎病变及牙移动速度。Nishijima等[24]体外研究表明：在人类牙周韧带细胞中，压力显著增加RANKL的分泌，而减少OPG的分泌，且与时间和作用力的大小呈依赖性。Kanzaki等[24]检测牙周韧带细胞在体外周期性牵张力机械地作用下发现，不仅RANKL mRNA的表达上升，而且OPGmRNA的表达也上升，同样牵张力也使牙周韧带细胞中的TGF-β表达上升，给予TGF-β中和抗体能抑制OPG表达上调，呈剂量大小依赖性，牵张力通过TGF-β的刺激诱导OPG的表达上升，从而抑制牙周韧带细胞中破骨细胞的产生。李小彤等[25]研究发现，幼年鼠正畸牙齿移动中加力后3小时张力侧近牙槽骨表面即可见OPG表达阳性细胞排列，而压力侧牙周膜细胞的OPGmRNA表达在加力前后未见明显改变。在过大正畸力导致外源性根尖吸收的病人牙周韧带细胞中，严重的根吸收组与非吸收组相比RANKL增加和OPG下降很明显，抗酒石酸盐阳性细胞的数目和骨吸收陷窝也增加。可见严重外源性根尖吸收的受压牙周韧带细胞可以产生大量的RANKL，RANKL/OPG的比值增加，并且促进破骨细胞的产生[27]。Oshiro等[28]研究揭示OPG基因敲除鼠在切牙的移动中可检测到破骨细胞数量增多，牙槽骨破坏严重，而RANKL的表达量与正常鼠一致，表明RANKL/OPG的相对浓度决定了牙槽骨的的骨吸收平衡。Kanzaki[29,30]以质粒转染OPG基因到失活HVJ中，局部注射到大鼠正畸牙的牙周组织，发现OPG表达增加，破骨细胞生成受到抑制，显著降低正畸牙齿的移动速度。反之，局部注射RANKL基因后能诱导牙周组织RANK L的表达，促进破骨细胞生成，加速牙齿移动，缩短正畸治疗时间，从而证明OPG/RANKL系统在牙槽骨改建中发挥重要调节作用。Dunn等[31]建立上颌第一磨牙近中移动的鼠正畸模型，同时将OPG-Fc分别以0.5 mg/kg和5.0 mg/kg浓度每周2次注射于上颌第一磨牙近中侧，结果两组在7,14,21 d内磨牙移动均较对照组减少，且以5.0 mg/kg浓度组更明显。

3.OPG/在牙萌出的研究进展

牙齿萌出的机制十分复杂，研究证明牙齿的萌出依赖于牙囊。目前对启动牙齿萌出的分子调控机制的研究，主要集中在一些生长因子对牙囊的调节作用。这些调控因子主要包括巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)、白细胞介素-1α(IL-1α)及其受体、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、单核细胞趋化性蛋白-1(MCP-1)、破骨细胞分化因子／骨保护素(RANKL/OPG)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)、c-fos等。研究表明[32,33]，RANKL基因敲除小鼠表现为严重的骨质硬化和牙萌出困难，体内破骨细胞数明显减少。Wise等[34,35]检测到鼠下颌磨牙萌出时牙囊中OPG基因表达的减弱伴随着单核细胞的大量聚集，接近牙囊的牙槽骨基质细胞有RANKL表达，提示它可能参与单核细胞的融合，从而改变OPG与RANKL之间的平衡，使破骨细胞形成和激活，伴随牙槽骨吸收的牙萌出过程得以调控；认为在牙齿发育的特定时期，OPG受CSF-1和PTHrP等因子的抑制，使组织局部的RANKL发挥更多的作用来促进破骨细胞分化激活[36]。2004年YAO[37]等人采用激光显微切割技术从鼠的牙囊细胞中首次检测到RANKL mRNA的表达。这一发现对于研究牙齿萌出具有重大意义，证明了牙齿萌出通道形成必需的RANKL不仅来源于牙槽骨，还存在于牙囊。Liu等[38]研究结果证明牙囊细胞也存在RANKL的表达。

4.OPG在慢性根尖周炎中的研究进展

慢性根尖周炎的重要病理学特征之一是炎症性骨吸收，这与局部破骨细胞的形成和功能关系密切。RANKL和OPG在介导破骨细胞分化和活化的过程中，分别是重要的正性和负性细胞外调节因子。Renato等[39]采用real-time PCR的方法检测了人根尖肉芽肿OPG和RANKLmRNA的表达，结果表明与正常人牙周组织相比，OPG和RANKL的mRNA的表达均升高。范容等[40]采用免疫组织化学方法检测RANKL和OPG在根尖肉芽肿和根尖囊肿病损组织中的表达，认为慢性根尖周病损组织中的RANKL表达明显增多,RANKL/OPG比率显著上升，这与牙周炎和类风湿性关节炎等骨破坏性疾病的研究结果相一致[12,41]；分组研究表明，根尖肉芽肿组的RANKL和OPG表达均略强于根尖囊肿组，但差异并无统计学意义，且RANKL/OPG的比率在两组间的差异也无统计学意义。这些与Menezes等[42]2006年的研究结果基本一致，分析原因可能是根尖囊肿处于根尖病损发展的相对稳定阶段，其免疫反应和骨代谢的活跃程度可能相应降低。

5.OPG在口腔种植学中的研究进展

种植体周围炎是种植义齿修复后最常见的并发症，也是种植义齿修复后失败的最主要原因。由于种植体缺乏天然牙周的防御屏障，一旦发生炎症，扩散速度迅速，骨丧失明显。该炎症过程将影响已形成骨整合并行使功能的种植体周围组织，最终导致支持骨丧失、骨整合失败。目前临床的治疗方法有局部清创、药物、手术治疗及调牙合等，但均不能迅速抑制骨丧失。利用OPG强效抑制骨吸收的能力，将为种植体周围炎提供一条新的治疗途径。骨质疏松症常常被认为是是种植义齿的相对禁忌症。Motohashi等[43,44]通过动物实验的研究发现，骨质疏松鼠早期种植体周新骨形成及分布与正常鼠相同，只是形成速度较慢，数量较少，而后期新骨的吸收速度较快。Becker等[45]认为骨质疏松患者种植体与骨结合因骨量减少及骨组织微结构的改变而受影响。以上研究提示我们，骨质疏松患者包括绝经后的妇女，牙种植体的骨结合可能较差，将影响种植治疗的远期效果。利用OPG有效抑制骨吸收的特点，使用OPG蛋白或者基因治疗增加骨质疏松患者颌骨骨密度，可有望提高骨质疏松患者的种植成功率。

OPG/RANKL/RANK系统在骨吸收中起关键作用，在口腔科学中，其与牙周病造成的牙槽骨吸收，正畸牙移动过程中牙槽骨的改建及牙齿萌出等均存在明显的相关性。进一步研究OPG/RANKL/RANK系统在口腔骨组织吸收中的作用具有重要意义。

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