微生物转化在中药活性成分研究中的应用

高宁，程玉鹏，2，毕珊珊，李慧玲，刘莉莉，蒋倩倩，王振月

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨 150025;3.鹤岗市人民医院，黑龙江 鹤岗 154100)

1 微生物转化概述

1864年巴斯德发现乙酸杆菌能将乙醇氧化为乙酸，开启了人类通过微生物方法合成化学物质的大门，而20世纪50年代利用微生物对甾体化合物的结构改造成为了工业化微生物转化最重要的里程碑，特别是Murray和Peterson利用黑根霉(Rhizopus nigricans)与紫罗兰梨头霉(Tieghemella orchidis)中的羟化酶对底物的选择性羟基化反应，奠定了生物合成甾体药物的研究基础。自20世纪90年代开始，微生物多样性的研究逐步深入，同时基因组学、蛋白质组学、代谢组学和代谢工程的迅猛发展，为药学工作者提供了大量的、潜在可用的生物催化剂和生物合成途径，同时也为生物转化生产化学品提供了理论基础。从已有的研究来看，能够进行转化反应的微生物种类繁多、其所含酶的类别多种多样、反应底物结构各异、反应类型也不尽相同，因此，微生物转化可以挖掘的潜力是巨大的。

微生物转化是指利用微生物细胞或其所含酶系对外源化合物进行结构修饰和改造而获得所需要的目的产物的生理生化反应。其本质就是微生物将作为底物的化合物转化成为产物的过程，主要涉及羟基化、环氧化、脱氢、加氢、水解、酯化、脱水、糖基化等各类化学反应。微生物培养简单、种类繁多、酶系丰富，是一种最常见的、有效的生物转化载体，利用微生物整体细胞或分离酶为反应催化剂的生物转化或生物催化技术，已成为生物转化技术中发展最迅速的分支之一，广泛应用于天然化合物的生物合成;前体化合物的生物转化;药用成分筛选及新药开发、药物代谢研究等诸多领域［1］。

2 微生物转化的作用机理

微生物转化生产药用活性成分主要得益于微生物生长过程中所产生的多种酶及酶系，如纤维素酶、蛋白酶、酯酶等。作为生物催化剂，酶能够使复杂的化学反应在常温常压下高效快速的完成，微生物转化可以通过多种方式应用于药用成分的生产中。

首先，微生物所产生的多种酶能够对药用成分进行转化，产生新的化合物，从而能够开发出具有新特性的药用成分;其次，许多微生物生活环境特殊，能够产生一些不同于植物的新成分;另外，微生物在与植物相互作用中能够互相调节与影响，并存在一定的物质交流与交换，利用微生物转化能够调节药用植物中各组分的比例，提高目的产物的含量;而且，微生物转化能够改变部分药用成分的结构，能够应用微生物转化技术降解有毒成分，改变药性、提高药效。

3 微生物转化在药用植物活性成分研究方面的应用

微生物转化涉及的反应多种多样，且能够通过一系列化学反应产生复杂的新化合物，因此，人们可以通过微生物转化法寻找新的有药用价值的衍生物，也可以寻找使这些反应发生的微生物的酶，进而用于工业化生产。近年来药学工作者广泛开展了微生物转化体系的研究，以天然药物活性成分研究为出发点，对甾体类、萜类、生物碱类、黄酮类和蒽醌类等活性化合物进行结构修饰的研究并取得了一些成果［2－4］。

3.1 甾体类化合物的微生物转化研究

蟾蜍甾烯(bufadienolides)是一类C－17位连接六元不饱和内酯环的甾体化合物，近年来研究发现，其有显著的抗肿瘤作用［5］，但由于此类化合物对人体有一定的毒副作用，同时，游离型蟾蜍甾烯水溶性也较差，其临床应用受到限制。因此，叶敏等［6］利用微生物体系对蟾蜍甾烯进行了生物转化研究，获得了80余个转化产物，其中50余个为新化合物;发现了较罕见的在C－7β、C－15及C－16α等位点的羟基取代，并初步探索了蟾蜍甾烯的细胞毒活性的构效关系。

洋地黄强心苷类(digitalis glycosides)是一类有强心作用的苷类化合物，应用于临床已有200余年的历史，至今仍是治疗充血性心力衰竭的主要药物之一。利用生物转化的方法对洋地黄毒苷进行结构修饰已成为研究的热点［7－9］。王丽娟等［10］选用新月弯孢霉AS3.3589转化洋地黄毒苷得到2个产物，转化率分别为27%和5%;蓝色犁头霉CICC40302转化洋地黄毒苷得到1个产物，转化率为6%。

3.2 萜类化合物的微生物转化研究

雷公藤二萜是卫矛科植物雷公藤的主要有效成分，具有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤等多种生理活性，但其较大的肾毒性限制了雷公藤二萜的临床应用。宁黎丽等利用短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.970)对雷公藤甲素(triptolide)进行微生物转化，得到7个极性都大于底物的产物，其中5α－羟基雷公藤甲素、19α－羟基雷公藤甲素、19β－羟基雷公藤甲素、1β－羟基雷公藤甲素为新化合物［11］;同时，利用黑曲霉(Aspergillus niger AS 3.739)对雷公藤内酯酮进行微生物转化，分离并鉴定了4个产物，其中17－羟基雷公藤内酯酮、16－羟基雷公藤内酯酮、5α－羟基雷公藤内酯酮为新化合物［12］。以上研究为利用微生物转化技术生产高效低毒的雷公藤二萜衍生物奠定了基础。

甘草次酸为中药甘草中的主要成分，具有显著的中枢性神经镇咳作用和抗炎作用。辛秀兰［13］等利用多型孢毛霉(Mucor polymorphosporus AS3.3443)对甘草次酸进行了生物转化研究，分离得到7个化合物，其中 6β － hydroxyglycyrrhetinic acid、7α － hydroxyglycyrrhetinic acid、3－O －acetyl－7β －hydroxyglycyrrhetinic acid、3－oxo－7β －hydroxyglycyrrhetinic acid、3－oxo－15α－hydroxyglycyrrhetinic acid为新化合物。

3.3 生物碱类化合物的微生物转化研究

喜树碱是一种从喜树中提取得到的具有较好疗效的抗肿瘤药物，对胃肠道和头颈部癌等有较好的近期疗效，但对少数病人有尿血的副作用;10－羟基喜树碱抗癌效果超过喜树碱，而其副作用较小，因此，如何利用微生物转化技术将喜树碱转化为10－羟基喜树碱从而提高后者的含量受到目前许多药学工作者的关注，并取得了较大进展。朱关平［14］采用无毒黄曲霉菌株T－419(CGMCCO158)，将在喜树中含量较高的喜树碱转化为10－羟基喜树碱，转化率达50%以上。李丽等［15］利用紫微青霉(Penicillium janthinellum)对吴茱萸碱的生物转化进行了研究，分离并鉴定了2个化合物。

紫杉醇(paclitaxel)是1971年Wani等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)中分离出的一个紫杉烷二萜生物碱类成分，被认为是目前最为有效的抗肿瘤药物。占纪勋等［16］利用铜绿假单孢菌(Pseudomonas aerugi-nosa AS1.860)对紫杉醇进行微生物转化，并分离出3个转化产物，分别鉴定为baccatinⅢ，baccatin V和10－去乙酰baccatinⅢ，其中产物baccatinⅢ和10－去乙酰baccatinⅢ也是人体代谢的产物。

3.4 黄酮类化合物的微生物转化研究

葛根素是葛根的主要有效成分，但其较低的水溶性使得注射给药存在较大困难。为提高其水溶性，利用能够产生麦芽糖淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearo－thermophilus)对其进行微生物转化，得到α－D－葡萄糖基－(l→6)－葛根素和α－D－麦芽糖基－(l→6)－葛根素两种主要产物，溶解度分别是葛根素的14 倍和168 倍［17］。

王园 园 等［18］利 用 Streptomyces griseus ATCC 13273对黄酮类化合物柚皮苷，橙皮苷，黄芩苷及木犀草素进行生物转化，分别得到6个转化产物为柚皮素－7－O－葡萄糖苷，柚皮素，橙皮素，黄芩素，黄芩素－6－甲氧醚和柯伊利素。结果表明，此转化过程中涉及到两类反应，即糖苷水解和甲基化反应，S.griseus产生的L－鼠李糖苷酶对底物有特异选择性，β－D－葡萄糖苷酶的选择性不强，甲基转移酶仅对黄酮类化合物的特异位点进行甲基化。

3.5 蒽醌类化合物的微生物转化研究

大黄中的蒽醌类化合物分为游离型与结合型，现在已知共计20余种，如大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，在预防和治疗肿瘤、抗氧化等方面表现出较好的疗效。为了进一步提高药效、降低毒副作用，采用微生物转化技术对大黄中游离型蒽醌类化合物进行了结构修饰。分别应用蓝色梨头霉(Absidia coerulea)和刺囊毛霉(Mucor coerulea)对大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素分别进行转化，得到了7种β－D－吡喃葡萄糖苷衍生物和一个ω－羟基大黄素［19－20］:其中蓝色梨头霉的转化产物分别为大黄酚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚－8－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黄素－6－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、芦荟大黄素－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷;刺囊毛霉的转化产物分别为大黄酚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚－8－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、ω－羟基大黄素基。

4 结语

由于微生物培养简单、种类繁多、酶系丰富，具有化学催化剂所没有的许多优点，因此微生物转化技术在药用植物活性成分研究中的运用是中药生物技术研究领域的一个热点内容。微生物转化可以有效地提高已知的天然活性先导化合物的活性、降低毒副作用、改善水溶性和生物利用度，也可以用来生产具有重要应用价值的微量天然活性先导化合物，同时可用于药物代谢机制的研究。因此，需要充分利用和发展新的技术和方法，加快微生物转化技术在药用植物活性化合物研究中的应用，获得结构新颖、药效良好的新药，解决人民的健康问题。

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