HA-PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的影响

邓 欣,张 帆,张国利,李亘松,b,于秉治

（1.中国医科大学a.基础医学院机能实验中心;b.生理学教研室;c.生物化学与分子生物学教研室,辽宁沈阳110001;2.军事医学科学院11所）

受精卵的发育过程是卵细胞内一系列信号蛋白相互作用的结果。蛋白激酶B（PKB/Akt）在其发育的过程中起了至关重要的促进作用[1],通过磷酸化Cdc25BSer351进而去磷酸化Cdc2A Tyr15而使有丝分裂促进因子MPF活化,然后1-细胞期受精卵分裂为2-细胞期受精卵。我们最近的研究脯氨酸丰富的肌醇多磷酸5-磷酸酶（PIPP）,在Akt的活化过程中起到了关键的调节作用[2-6]。Akt的活化需要PtIns（3,4,5）P3与Akt的PH域结合才能完成,而PIPP却可以水解PtIns（3,4,5）P3上第5位的磷酸盐PtIns（3,4）P2,从而抑制Akt的活化。本研究通过细胞免疫荧光分析法使用HA-PIPPH557A质粒观察其在受精卵中对卵裂的作用,并与HA-PIPP的作用进行比较,我们研究将为深入研究PIPP在小鼠受精卵早期发育中的信号传递作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒和菌株 HA-PIPPH557A和HA-PIPP以及HA vector由Mitchell教授惠赠（澳大利亚Monash大学）;DH5α购自大连宝生物有限公司。

1.2 动物来源 中国医科大学实验动物部提供昆明系4-5周龄性成熟雄性及雌性小白鼠。

1.3 相关分子生物学试剂 孕马血清促性腺激素（PMSG）购自长春军事医学科学院军事兽医研究所;人绒毛促性腺激素（hCG）购自中国医科大学第二临床医院药局;小鼠抗pAkt Ser473多克隆抗体;辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG（Santa）及FITC（异硫氰酸荧光素）标记的兔抗IgG抗体购自北京中山生物技术公司:Wortmannin,Hochest33258荧光染料购于Sigma公司。限制性内切酶M luI（MBI公司）;质粒DNA纯化试剂盒（上海生工）;LB培养基（Invitrogen）;牛血清白蛋白（BSA,FractionⅤ）;M2培养液;矿物油;M16培养液（Sigma）;氨苄青霉素（Amp）（哈药集团制药总厂）。

1.4 小鼠超排卵及受精卵的采集和培养 根据Hogan的方法进行小鼠卵的超排和收集[7]。

1.5 质粒 DNA提取与转染 HA-PIPP、HA

PIPPH557A和HA vector经转化,提取后,经M luI（5'-A^CGCGT-3';3'-TGCGC^T-5'）单酶切进行鉴定,用1%琼脂糖电泳检测酶切结果,选择酶切片段大小与预期相符合的阳性克隆保存用做重组质粒构建。

转染前分别将小鼠受精卵接种于含100μlM16培养液的96孔板中,转染时受精卵处于G1期（受精后0-9 h）。脂质体LipofectamineTM 2000的转染按试剂说明书进行。无菌条件下,在含24.5μl的M16培养液的 Eppendorf管中加入 0.5μl的 LipofectamineTM2000脂质体,同时在另一含 23.5μl的 M16培养液中加入1.5μl（0.2μg）HA-PIPP或HA vector质粒,室温静置5min。然后加入脂质体与质粒DNA的复合物共50μl置于37℃,5%CO2培养箱中培养6 h,吸去培养液,加入正常培养基,继续培养至24 h。以上各孔重复3次。

1.6 间接免疫荧光 取转染HA-PIPP组和HAPIPPH557A组受精卵放入4%的多聚甲醛中固定30 min,0.1%Triton x-100固定10min,用含1%牛血清白蛋白的PBS室温下封闭40min,加入抗pAktSer473的抗体（1∶500）4℃过夜,次日加入FITC标记的一抗（1∶1 000）37℃40min,用碘化丙啶（PI）染色4 min,使核酸着色,在激发光为488 nm和530 nm的荧光显微镜下观察pAktSer473的定位以及在HA-PIPP或HA-PIPPH557A作用下发生卵裂的相应改变。

1.7 受精卵卵分裂的计数 受精卵分为5组:未处理组（untreated）、渥太霉素组（wortmannin）、转染HA vector组、HA-PIPP组和HA-PIPPH557A组,之后在M16培养液中培养至G2/M转换期,在HCG注射后30 h计数1-细胞期受精的分裂数,并进行统计学分析。

1.8 数据处理 应用SPSS 11.5统计学软件进行one-way ANOVA检验,值用mean±SD表示,每组实验重复3次,P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 相差显微镜下HA-PIPPH557A的过度表达对受精卵卵裂的形态学观察 转染HA-PIPPH557A与HAPIPP质粒的小鼠受精卵分别在M 16培养液中培养,记录各组细胞卵裂情况,并于注射hCG后30 h,相差显微镜下观察并照相。在转染HA-PIPPH557A组,hCG注射26 h处于1-细胞期,27 h开始出现2-细胞期受精卵,到30 h有大约半数以上的卵达到了2-细胞期,然而,转染HA-PIPP组仅不到15%的卵进入2-细胞期（图1）。

2.2 HA-PIPPH557A的过渡表达对受精卵卵裂率的影响 G1期受精卵分别用HA-PIPPH557A（0.05 ng）、HA-PIPP（0.05ng）、HAvector（0.05ng）和Wortmannin处理以及未处理的卵。相差显微镜下计数发生卵裂的个数。HA-PIPPH557A、HA vector以及未处理组在hCG后28.5 h开始出现卵裂,至30 h约有55%以上分裂成2-细胞期胚胎,三组之间相比差异没有显著意义（P＞0.05）。HA-PIPP与Wortmannin处理组卵裂率均低于15%,它们的结果与FLAG-PIPP-H557A处理组相比差异显著（P＜0.001）,（见表1和图2）,每组实验至少重复3次。

图1 PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的形态学观察

图2 HA-PIPPH557A的过度表达对受精卵卵裂率的影响

表1 小鼠受精卵分裂百分数的组间比较

3 讨论

本研究显示HA-PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的影响,揭示了 PIPPH557A作为 PIPP的失活形式在PI3K/Akt信号途径中对受精卵发育的调节作用。以前对体细胞的研究报道显示,PIPP可以降低Akt Ser473的磷酸化。我们以前的研究也显示,Akt在小鼠受精卵的有丝分裂过程中可以促进MPF的活化进而促进受精卵的有丝分裂,而PIPP可以通过抑制Akt活性调节G2/M期的转化,降低受精卵的卵裂率和MPF的活性。

以前的报道显示,PI3K活化可以产生PtdIns（3,4,5）P3,PtdIns（3,4,5）P3与Akt PH域的结合使Akt活化并聚集在细胞膜上[8,9],活化的Akt可以特异性的促进受精卵的有丝分裂,而作为Akt的抑制剂PIPP对PtdIns（3,4,5）P3第5位磷酸盐的的水解作用,相应的降低了Akt活化进而降低MPF的活性。我们以前的结果与上述报道相一致。而PIPP的5-磷酸酶结构域中组氨酸557位点突变为丙氨酸时的PIPPH557A对Akt以及在小鼠受精卵中的作用,一直没有文献报道。小鼠受精卵是研究脊椎动物细胞周期较好的模型之一,关于小鼠受精卵的早期发育机制一直是国内外研究的热点之一,而众多关于有丝分裂的研究几乎都工作在细胞是如何跨越分裂间期（包括G1、S和G2期）到达分裂期（M 期）[7-10]。本研究使用HA-PIPPH557A通过荧光显微镜和解剖显微镜观察了PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的影响,我们发现PIPPH557A与PIPP的活性形式不同,它不能阻止Akt在细胞膜定位的活化形式进而不能阻止受精卵的卵裂。,所以PIPPH557A在受精卵发育的有丝分裂过程中起了关键的调节作用。

总之,我们的实验结果显示PIPPH557A在小鼠受精卵发育的有丝分裂过程中起了重要的调节作用,它可以通过减弱PIPP对AktSer473位点的磷酸化的抑制作用,间接调控细胞有丝分裂的进程。

致谢:感谢澳大利亚Monash大学的Mitchell教授赠送我们HA-PIPPH557A和HA-PIPP质粒。

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