新藤黄酸诱导人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡以及对p-p38和p-ERK1/2蛋白的影响

晏烽根，李庆林

(省部共建新安医学教育部重点实验室，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽中医学院，安徽合肥 230038)

新藤黄酸是从中药藤黄中提取分离出来的有效成分，我们实验室前期对新藤黄酸体内外抗肿瘤作用进行了初步探讨，表明新藤黄酸能够抑制肿瘤细胞生长，包括人结肠癌细胞 HT-29、人肝癌细胞BEL-7402、人白血病细胞K562等，并能诱导人非小细胞肺癌细胞A549凋亡［1］。而在鼻咽癌的研究中已有药物能诱导鼻咽癌细胞凋亡，例如高三尖杉酯碱和茶中多酚类物质EGCG等报道［2－3］。但新藤黄酸对鼻咽癌细胞CNE-1的作用尚未见报道，因此本文进行了这方面研究。

1 材料与方法

1.1 材料药物:新藤黄酸(纯度:≥99.0%;批号:20090314)为安徽中医学院自制;抗体β-actin、Cytochrome C、p38、ERK1/2 购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)公司;Caspase-3 购自Bioworld(Bioworld Technology，MN，USA);p-p38、p-ERK1/2购自Cell Signaling(Cell Signaling Technology，MA，USA)公司;Western blot和其他试剂来自Abcam(Cambridge，MA，USA)或者 Sigma-Aldrich(Saint Louis，MO，USA)公司。

1.2 细胞培养鼻咽癌细胞CNE-1购自美国细胞菌种库(ATCC)，细胞在体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。并于37℃，5%CO2条件下恒温恒湿培养箱中培养，选取对数生长期细胞进行实验。

1.3 倒置显微镜观察细胞形态变化选取CNE-1细胞对数生长期接种于6孔板，并贴壁培养过夜。各实验组按要求给予新藤黄酸不同浓度和时间的药液加药处理细胞，同时设control组，处理完后在倒置显微镜下观察并拍照。

1.4 MTT实验CNE-1细胞用胰酶消化并稀释约为1×106·L－1的活细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔180 μl，每组设6个复孔，贴壁过夜后加不同浓度的新藤黄酸药液20 μl，使其终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 μmol·L－1，control组加入20 μl完全培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养不同时间(24、48和72 h)，每孔加入5.0 g·L－1的 MTT 20 μl，继续孵育4 h 后，小心吸弃全部上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡后，用酶标仪(570 nm)记录各孔的吸光度(OD)，细胞存活率/%=处理组OD/对照组(control)OD×100%，实验重复3次。

1.5 流式细胞仪检测CNE-1细胞凋亡率采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，取对数生长期的CNE-1细胞接种于6孔培养板，培养过夜后弃去原来培养基，加入2.0 μmol·L－1新藤黄酸后继续培养，control组则换用完全培养基。作用不同时间后，用0.25%胰酶消化细胞(不含EDTANa)，各组样本细胞数调整为1×106～5×106·L－1，2 000 r·min－1离心5 min 弃去培养液。PBS 洗涤 2 次，2 000 r·min－1离心 5 min。加入 400 μl缓冲液重悬细胞。加入5 μl AnnexinⅤ混匀后再加入5 μl PI混匀。室温下避光孵育15 min。1 h内流式细胞仪检测。

1.6 观察CNE-1细胞凋亡形态细胞接种于6孔板，过夜贴壁培养后再加新藤黄酸处理24 h，control组加完全培养基继续培养。胰酶消化后收集细胞，PBS洗两遍，用戊二醛固定，电镜观察并细胞摄片。

1.7 Western blot检测蛋白变化CNE-1细胞在2.0 μmol·L－1新藤黄酸不同时间作用后用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。10%～15%分离胶和5%浓缩胶进行SDSPAGE电泳，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。再5%脱脂奶粉封闭，4℃一抗孵育过夜。PBST洗涤3次，每次10 min。再加HRP标记的二抗稀释液温育2 h，PBST洗涤3次，每次10 min。用ECL进行显影，Bio-Rad凝胶成像系统采集图片。

1.8 统计学分析实验数据以±s表示，采用Prism 5.0 software(Graph Pad software，San Diego，USA)统计软件进行单因素方差分析及两个独立样本的t检验。

2 结果

2.1 新藤黄酸抑制CNE-1细胞生长在不同的浓度和不同时间经过新藤黄酸处理CNE-1细胞后进行显微镜观察，可以看出在不同浓度新藤黄酸作用于CNE-1细胞24 h后，显微镜下观察发现部分细胞固缩变圆，体积变小，少量细胞贴壁不牢，呈半贴壁状态，尤其在高浓度(4.0、8.0 μmol·L－1)CNE-1 细胞多数固缩变圆，较多细胞脱落，漂浮于培养液中(Fig 1A)。在 2.0 μmol·L－1新藤黄酸作用 CNE-1细胞，随着时间的延长CNE-1细胞也出现细胞贴壁不牢，细胞数目减少，作用细胞48 h后，细胞基本脱落，碎裂并漂浮于培养液中(Fig 1B)。

2.2 新藤黄酸抑制CNE-1细胞的增殖MTT法检测表明，在 0.25 ～8.0 μmol·L－1浓度范围内的新藤黄酸处理人鼻咽癌CNE-1细胞24、48和72 h后，与control组比较，各给药组细胞存活率降低(P＜0.05或P＜0.01)，差异有统计学意义(Fig 2)。

2.3 新藤黄酸诱导CNE-1细胞凋亡2.0 μmol·L－1新藤黄酸作用24 h后可见大约50%的CNE-1细胞发生凋亡，并且随着作用时间增加细胞凋亡率也随之上升(Fig 3)。该作用通过透射电子显微镜得到了进一步的证实，电镜下细胞出现胞体皱缩变圆、胞质凝缩，细胞质失水浓缩，细胞核发生典型核染色质固缩、核碎裂成碎片等现象(Fig 4B)，其中可以观察到与control组相比新藤黄酸对线粒体的损伤，包括线粒体膜的破裂、肿胀(Fig 4D)，而正常线粒体形态正常，嵴清晰完整，排列整齐(Fig 4C)。这些结果显示，新藤黄酸能诱导CNE-1细胞凋亡。

Fig 1 A Morphological observation of Gambogenic acid inhibiting CNE-1 cells growth and viability by inverted microscope(×200)

Fig 2 Effects of Gambogenic acid on the viability of CNE-1 cells

Fig 3 Gambogenic acid-induced apoptosis rate in CNE-1 cells by flow cytometry

2.4 新藤黄酸影响CNE-1细胞内蛋白的表达在新藤黄酸2.0 μmol·L－1不同时间作用下CNE-1细胞内Cytochrome C和Caspase-3蛋白随着时间的增加蛋白表达量呈现时间依赖的增加(Fig 5)，为进一步探究新藤黄酸诱导CNE-1细胞凋亡的分子机制，还检测了细胞内 p38、ERK1/2、p-p38、p-ERK1/2 的蛋白表达情况，该结果表明在2.0 μmol·L－1新藤黄酸处理后p-p38在短时间内被激活(Fig 6A)，p-ERK1/2蛋白表达则呈现时间依赖性的减少(Fig 6)，而蛋白p38和ERK1/2的表达水平基本不变(Fig 6B)。

3 讨论

鼻咽癌的高发地区包括东南亚，还有北极地区的原住民，以及北非阿拉伯人和中东部分地区，尤其是在中国的广东省的中部［4］。而且儿童和成人鼻咽癌5年的存活率大约60%［5］。目前，鼻咽癌的治疗主要是依靠化学疗法和放射疗法或者两者相结合，新藤黄酸作为一种天然的植物提取物，具有前景的抗肿瘤药物，并具有抗癌谱广、毒性低特点，前期实验也表明新藤黄酸可以抑制结肠癌、肝癌、胃癌、非小细胞肺癌和卵巢癌细胞增殖［6］，已经越来越引起人们的关注。

Fig 4 Morphologic features of apoptosis analysis by transmission electron microscopy

Fig 5 Gambogenic acid increased expression of Cytochrome C and Caspase-3

Fig 6 Gambogenic acid effect on p-p38 and p-ERK1/2 protein expression A:120 min，B:36 h

本实验研究发现新藤黄酸在不时间和浓度下能抑制CNE-1细胞的增殖，诱导细胞凋亡。其凋亡机制可能与线粒体凋亡途径相关，通过电镜可以观察细胞内线粒体形态发生变化，并出现了线粒体膜通透性改变，线粒体膜受损。而且Western blot实验也检测到Cytochrome C和Caspase-3随着时间的延长蛋白表达量依赖性的增加。也有其他文献报道诱导鼻咽癌细胞凋亡通过线粒体信号途径［7］，这与本实验结果相类似。

MAPK家族在鼻咽癌抗肿瘤活性中起着重要的作用，越来越多的报道表明MAPK家族成员在鼻咽癌的研究中具有重要的生物活性［8－9］。p-ERK1/2和p-p38MAPK是MAPK信号传导通路中是重要的调控蛋白，对调控细胞增殖和细胞凋亡具有极其重要的作用［10－11］。实验结果表明:新藤黄酸处理CNE-1细胞后，p38、ERK1/2蛋白基本没有变化，pp38在短时间内被激活，p-ERK1/2则呈现时间依赖性的表达减少。这些蛋白的变化可能参与了新藤黄酸诱导细胞凋亡的过程。

许多抗肿瘤药物都可以诱导肿瘤细胞凋亡，并且细胞凋亡是抑制肿瘤生长和增殖的主要机制之一，最近有报道表明［12－13］诱导细胞凋亡可用于肿瘤的治疗。本实验研究了新藤黄酸诱导CNE-1细胞凋亡，其机制可能涉及线粒体凋亡途径，并且MAPK系统也参与凋亡进程中。希望本实验机制的探讨能为新藤黄酸开发为临床抗肿瘤药物提供参考价值和科学依据。

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