彭泽鲫葡萄糖激酶基因全长cDNA克隆及表达分析

程汉良 姬南京 彭永兴 申 欣 吴陈晨 许建和 董志国

(淮海工学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，连云港 222005)

葡萄糖激酶(glucokinase，GK，EC2.7.1.1)是糖代谢的关键酶，催化葡萄糖磷酸化生成6－磷酸葡萄糖(glucose-6-phophate，G-6-P)，这是糖元合成和糖酵解的第1步反应［1］。GK属己糖激酶(hexokinase，HK)家族成员之一，哺乳动物己糖激酶有同工酶Ⅰ～Ⅳ型，其中，Ⅰ～Ⅲ型主要存在于肝外组织，其Km值(Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度1/2时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一)为20～130μmol/L，G-6-P是其反馈抑制物;Ⅳ型主要存在于肝脏和胰岛β细胞，通常称之为GK。与其他3种已糖激酶相比，GK对葡萄糖的亲和力较低，其Km值为5～8 mmol/L，G-6-P对此酶无抑制作用［2］。当血糖浓度升高时启动GK，于是多余的葡萄糖最终被转化为糖原或脂肪贮存，胰岛素在转录水平上调控GK基因表达［3］，GK 基因突变可引起人类患 2 型糖尿病［4］。在鱼类中，特别是肉食性鱼类，对饲料中可消化碳水化合物作为能量供应的能力非常有限［5－6］，一些鱼类摄食富含碳水化合物饲料后会出现高血糖症［7－8］，饲料碳水化合物过高还可能是诱发养殖鱼类脂肪肝病发生的原因之一［9］，而GK基因因可能与上述问题有关而受到重视。目前，研究人员已对鱼类GK基因进行了一些研究，克隆了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、金鲷(Sparus aurata)、翘嘴红鮊(Erythroculter ilishaeformis)等鱼类的GK基因全长 cDNA 序列［10－12］，并对影响 GK 基因表达的营养和环境等因素进行了研究，为鱼类碳水化合物代谢调控研究奠定了基础。

彭泽鲫(Carassius auratus var.Pengze)是我国鲫鱼主要养殖品种。近几年，随着集约化养殖程度的提高，用于鱼类饲料蛋白质源的鱼粉资源不断减少。因此，优化饲料配方，提高碳水化合物用于能量消耗的比例，节约蛋白质的消耗，促进养殖鱼类健康生长，预防脂肪肝病的发生成为鱼类营养研究的热点。本研究从彭泽鲫肝胰脏中克隆GK基因全长cDNA序列，并对其组织表达进行研究，以期为通过营养调控鱼类GK基因表达研究奠定基础。由于GK把糖代谢和脂肪合成关联起来，因此，通过对GK基因的研究还可为探讨鱼类脂肪肝发生的营养机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用彭泽鲫于2008年5月采自江苏连云港市罗阳镇的精养鱼池，2龄，体重0.3～0.5 kg。运回实验室后于全自动水族箱中25℃暂养，适量投喂商品颗粒饲料，并于喂食后6 h取样。

1.2 肝胰脏总RNA的提取

取彭泽鲫活体解剖，快速分离肝胰脏，液氮研磨，采用 E.Z.N.A.TMTotal RNA kit I(OMEGA，USA)按推荐方法提取肝胰脏总 RNA，按膜上DNaseⅠ(OMEGA，USA)消化处理方案去除基因组DNA污染，1%琼脂糖电泳检测RNA完整性，核酸定量仪(PE，USA)检测RNA浓度，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀释至1μg/μL，－80℃保存备用。

1.3 cDNA第1链的合成和GK基因cDNA核心片段序列的克隆

以彭泽鲫肝胰脏总RNA为模板，Oligo(dT)18为反转录引物，使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(BBI，Canada)推荐方法合成cDNA第1链，20μL反应体系中含:彭泽鲫肝胰脏总RNA(1 μg/μL)5 μL、Oligo(dT)181 μL、DEPC 水5 μL、5×Buffer 4 μL、RNase抑制剂 1 μL、dNTP(10 mmol/L)2μL、AMV反转录酶2μL。根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio，BC122359)和鲤鱼(AF053332)GK基因保守序列设计1对基因特异性引物GK-F和GK-R，并根据斑马鱼 GK基因序列预测PCR产物大小(表1)，以上述第1链cDNA稀释10倍为模板，PCR扩增彭泽鲫GK基因一段855 bp的核心序列，50μL反应体系中含:模板2μL、浓度为25μmol/L的上下游引物各1μL、10×Buffer 5μL、浓度为 25 mmol/L的 Mg2+4μL、浓度为 25 mmol/L的 dNTP 1μL、浓度为5 U/μL的Taq酶0.4 μL，去离子水补充至50 μL。扩增条件为:94℃变性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸60 s，共30个循环;反应前 94℃预变性4 m in;反应后72℃充分延伸7 m in。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选5个PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司(上海生工)采用扩增引物进行正反双向测序。正反序列组装后得到GK基因的核心序列，并根据此序列设计3'cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)和5'RACE的引物。

表1 用于GK基因cDNA RT-PCR和RACE的引物序列及预期产物大小Table 1 Primer sequence and expected product size for GK gene cDNA RT-PCR and RACE

1.4 彭泽鲫GK基因3'RACE

使用 TaKaRa的3'-Full RACE Core Set试剂盒，按推荐方法快速扩增GK基因3'末端，3'RACE使用的引物见表1。首先，以Oligo(dT)16AP为引物反转录肝胰脏总RNA，获得cDNA第1链，稀释10倍后，以GK3-F1和AP为引物进行第1轮PCR扩增。第1轮扩增产物稀释10倍后，用GK3-F2与Race3-R进行第2轮PCR扩增，PCR反应体系和条件同核心序列的扩增。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，胶回收方法采用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit(BBI，Canada)推荐方法;然后用 PCR Product Cloning Kit(BBI，Canada)推荐方法将回收的 PCR产物与pUCm-T载体连接，转化感受态细胞DH5α，在含有青霉素，并涂有IPTG和X-gal的LB平板上培养16～20 h，挑白斑在含青霉素的LB液体培养基中扩大培养16 h，使用EZ-10 Spin Column Plasm id M ini-preps Kit(BBI，Canada)提取质粒，用 GK3-F2和Race3-R为引物进行PCR验证，选5个阳性质粒送上海生工采用M 13通用引物双向测序。

1.5 彭泽鲫GK基因5'RACE

参考 Dieffenbach等［13］的方法快速扩增 GK基因5'末端，5'RACE使用的引物见表1。首先，以GK5-R为引物反转录肝胰脏总RNA，获得cDNA第1链;然后用RNase H(Fermentas，Canada)分解cDNA-RNA杂交体中的RNA，乙醇沉淀;再使用末端脱氧核苷转移酶(Fermentas，Canada)在5'端加多聚A(polyA)尾，20μL反应体系如下:在有沉淀的原管中加入5×Buffer 4μL、dATP(100 mmol/L)1μL、末端脱氧核苷转移酶(20 U/μL)1.5 μL，无菌水补至 20 μL。反应条件为:37℃温育30 m in，70℃灭活10 m in，用 TE缓冲液稀释10倍后备用;最后，以Oligo(dT)16AP和GK5-R1为引物进行第1轮PCR扩增，第1轮扩增产物稀释10倍后，用Race3-R与GK5-R2进行第2轮PCR扩增，PCR反应体系和条件同核心序列扩增。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带并回收，克隆测序，方法同3'RACE。

1.6 序列分析

用 DNAstar Package(Version 5.01)软件包中的SeqMan对正反序列进行组装，当正反序列出现不配对情况时，查阅荧光图谱进行校正，分别得到GK基因cDNA的核心序列、3'末端序列和5'末端序列，然后用SeqMan将3段序列组装成完整的GK基因全长cDNA序列。用EditSeq对得到的序列进行编辑和分析，寻找开放阅读框(ORF)，并使用脊椎动物密码子翻译成氨基酸序列。通过查询http://www. predictprotein.org/和 http//www.EMBL-Heidelberg.de对编码蛋白质的2级结构进行预测;从GenBank下载6种鱼类、10种哺乳类、1种鸟类和1种两栖类动物的GK氨基酸序列，与本研究获得的彭泽鲫氨基酸序列用MEGA Version 3.1采用邻接(neighbor-joining，NJ)法(Amino:pdistance model，10 000 replicates，boostrap phylogeny test)［14］构建基于 GK氨基酸序列的分子系统发育树。

1.7 彭泽鲫GK基因在不同组织的表达

取3尾彭泽鲫活体解剖，快速分离大脑、白肌、脾脏、肠系膜脂肪和肝胰脏等组织，分别提取总RNA，按膜上DNaseⅠ消化处理方案去除基因组DNA污染，1%变性琼脂糖电泳检测RNA完整性，核酸定量仪检测RNA质量和浓度，用DEPC水稀释至1μg/μL。分别以Oligo(dT)18反转录合成cDNA第1链，稀释10倍，用 GK-F1与 GK-R为引物进行PCR扩增。同时，以β-actin为内标，用Actin-F和Actin-R为引物(表1)在不同管中进行PCR扩增，25μL反应体系中含:模板1μL、浓度为25μmol/L的上下游引物各 0.5μL、10×Buffer 2.5μL、浓度为25 mmol/L 的 Mg2+2 μL、浓度为 25 mmol/L 的 dNTP 0.5 μL、浓度为5 U/μL的Taq酶0.2 μL，去离子水补充至25 μL。扩增条件为:94℃变性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸40 s，共28个循环;反应前 94℃预变性4 m in;反应后72℃充分延伸7 m in。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。为避免样品中的DNA污染，各组均设以总RNA为模板的阴性对照1个。

2 结果与分析

2.1 彭泽鲫GK基因全长cDNA序列分析

对GK cDNA核心序列以及克隆的3'RACE和5'RACE的PCR产物进行测序，分别得到长度为855、965和373 bp核苷酸片段。将上述3段序列进行组装，去掉重复序列后得到彭泽鲫GK基因全长 cDNA序列，并提交 GenBank(登录号:GU065315)，其全序列和推测的氨基酸序列如图1所示。该cDNA全长2 050 bp(不含polyA)，含有1 431 bp的完整开放阅读框，编码476个氨基酸，其中，5'端非翻译区 67 nt，3'端非翻译区 552 nt。在启始密码子ATG的－3位为A，－6位为G，符合Kozak规则，在该阅读框终止密码子TGA下游有典型的AATAAA加尾信号，这些都符合有效翻译基因全长cDNA的特征。

彭泽鲫GK蛋白计算分子量为53.78 ku，等电点为5.14。其氨基酸序列中可能的基序包括:1个己糖激酶标签序列(hexokinases signature)，Leu156-Phe181;2个N－连接糖基化位点(N-linked glycosylation site)，Asn176和 Asn214;1个细胞黏附序列(cell attachment sequence)，Arg202-Asp204;1个糖胺聚糖黏附位点(glycosam inoglycan attachment site)，Ser455-Gly458;4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点(phosphorylation site);9个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位点;10个N－连接酰基化位点(N-linked myristoylation site)。彭泽鲫GK氨基酸序列与其他脊椎动物相比有极高的相似性，与建鲤(C.carpio var.Jian)、翘嘴红鲌、虹鳟、金鲷、人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)和爪蟾(Xenopus laevis)的相似百分比分别为98.1%、95.4%、86.0%、85.7%、79.8%、79.1%和79.3%。

图1 彭泽鲫G K基因全长cDNA序列及其翻译的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence of GK gene full-length cDNA and the deduced am ino acid sequences in C.auratus var.Pengze

2.2 基于GK基因编码氨基酸序列的聚类分析

基于7种鱼类、11种内温动物和1种两栖类动物GK基因编码氨基酸序列构建了系统发育树，其拓扑结构显示:作为低等脊椎动物，所有鱼类聚为一枝，与高等动物分开。在鱼类，同属鲤科的建鲤、彭泽鲫、翘嘴红鲌、斑马鱼和草鱼(Ctenopharyngodon idella)聚为一枝，自展支持率为100%，而同属真骨鱼类的虹鳟和金鲷聚为一枝。在内温动物，同属灵长类的人、黑猩猩(Pan troglodytes)和猕猴(Macaca mulatta)聚为一枝，自展支持率99%，然后所有的哺乳动物聚为一枝与鸟纲的家鸡(Gallus gallus)分开，最后哺乳动物和家鸡等内温动物聚为一枝，自展支持率99%，与两栖类的爪蟾分开(图2)。由GK氨基酸序列所反映的系统发育关系与传统分类基本一致。

图2 采用NJ法基于GK氨基酸序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on glucokinase am ino acid sequences using NJmethod

2.3 彭泽鲫GK基因的组织表达

通过半定量RT-PCR方法对GK基因在大脑、白肌、脾脏、肠系膜脂肪和肝胰脏等组织中的表达进行了研究，结果如图3所示。可知，GK基因主要在肝胰脏中表达;同时，在脾脏、肠系膜脂肪和大脑中也检测到微量表达，但GK基因表达量显著低于肝胰脏(P＜0.05);白肌中没有检测到GK基因表达。而阴性对照组没有扩增产物(结果未显示)，表明没有基因组DNA污染。

图3 GK基因在彭泽鲫不同组织中的表达Fig.3 Expression of GK mRNA in different tissues of C.auratus var.Pengze

3 讨论

3.1 GK肽链与其他脊椎动物比较

本研究采用RT-PCR和RACE方法从彭泽鲫肝胰脏中克隆了GK基因全长cDNA序列，该cDNA编码476个氨基酸。将彭泽鲫GK氨基酸序列与人、大鼠、爪蟾、建鲤、翘嘴红鲌、虹鳟和金鲷等脊椎动物的GK氨基酸序列进行比对，结果见图4。

哺乳动物GK分子量约50 ku，是己糖激酶Ⅰ～Ⅲ型的1/2，只含1个结构域，大鼠GK与脑己糖激酶Ⅰ型的C－端有75%的相似性［15］。己糖激酶基因家族催化葡萄糖生成G-6-P的ATP依赖型磷酸化反应，是糖酵解途径的限速酶，控制糖代谢的第1步反应。与己糖激酶Ⅰ～Ⅲ型不同，GK不受产物G-6-P的反馈抑制，因此，GK在肝细胞和胰岛β细胞中作为葡萄糖传感器和代谢发生器具有重要生理功能［2］。GK主要功能位点包括:ATP结合位点、葡萄糖结合位点、N－连接糖基化位点等。大鼠GK氨基酸残基Asp78-Lys90以及13个氨基酸之后的Lys102(大鼠氨基酸残基编号)对于与ATP结合非常重要［15］，包括彭泽鲫在内的所有物种这一结构域非常保守。在人类，GK氨基酸残 基 Ser152-Pro154、Asn167-Lys170、Asn205-Thr207、Ile226-Asn232、Asn255-Gly259、Gln288及 Glu291(人氨基酸残基编号)被认为是葡萄糖结合位点，特别是葡萄糖的所有氧原子与GK氨基酸残基Thr169、Lys170、Asn205、Asp206、Asn232、Glu257及 Glu291(人氨基酸残基编号)形成氢键［2，16］，上述氨基酸残基在所有脊椎动物中保守。

GK还含有1个保守的己糖激酶标签序列(Leu147-Phe162，人氨基酸残基编号)，在这些氨基酸残基中，除了Ile159在鲤科鱼类被Leu替代外，其他氨基酸残基在所有脊椎动物中基本保守。此外，所有脊椎动物GK氨基酸序列中都具有保守的N－连接糖基化位点(Asn167和Asn205，人氨基酸残基编号);细胞黏附序列(Arg193-Asp195，人氨基酸残基编号)和糖胺聚糖黏附位点(Ser446-Gly449，人氨基酸残基编号)。爪蟾GK氨基酸残基Glu51Glu52及His141-Leu144(爪蟾氨基酸残基编号)被认为是调控蛋白结合位点［16］，除 Glu51外，其他氨基酸残基在所有物种中也保守。

3.2 GK基因的组织表达

哺乳动物GK主要存在于肝和胰岛β细胞，胰岛素在转录水平调控其表达。鱼类肝胰脏GK基因仅在第1次喂食碳水化合物饲料后诱导表达，这与己糖激酶Ⅰ型基因从受精卵到胚后发育的各个阶段均表达不同［17］;虹鳟GK基因仅在肝脏和下丘脑中表达，并受营养条件调控，饥饿抑制GK基因表达，再摄食促进GK基因表达，喂食后6 h GK基因表达出现高峰，说明肉食性虹鳟鱼对饲料中碳水化合物利用率较低的原因不是肝脏缺乏可诱导的GK基因［18］。本研究结果表明，鲫鱼GK基因主要在肝胰脏中表达，但脾脏、肠系膜脂肪和大脑中也检测到微量表达，白肌中没有检测到GK基因的表达，这与虹鳟GK基因仅在肝脏和下丘脑中表达结果不同，因此，GK基因在鱼类的组织表达还需进一步研究。虹鳟肝脏GK活性及其基因水平随饲料淀粉或葡萄糖的增加而提高［19－21］;肉食性的金鲷通过GK的调节，可忍受饲料中蛋白质被碳水化合物部分代替［22－23］，饥饿降低金鲷肝GK基因表达水平，而饲喂高碳水化合物低蛋白质饲料或用胰岛素处理可促进 GK基因表达［7，24］。温度升高也可促进金鲷GK基因表达［25］。

图4 彭泽鲫与人、大鼠、爪蟾、建鲤、翘嘴红鲌、虹鳟和金鲷GK基因编码氨基酸序列比对Fig.4 Multiple alignment of the GK gene deduced am ino acid sequence from C.auratus var.Pengze w ith the corresponding sequences from Homo sapiens，Rattus norvegicus，Xenopus laevis，C.carpio Var.Jian，E.ilichaeformis，O.mykiss and S.aurata

4 结论

本研究从杂食性的成年鲫鱼肝胰脏中克隆了GK基因全长cDNA，其编码氨基酸序列的主要功能位点(ATP结合位点、葡萄糖结合位点、N－连接糖基化位点等)在硬骨鱼类及其他脊椎动物间高度保守，并证实了GK基因主要在彭泽鲫肝胰脏中表达，脾脏、肠系膜脂肪和大脑中微量表达，白肌中不表达。

［1］ KAWAIS，MUKAIT，MORIS，et al.Hypothesis:structures，evolution，and ancestor of glucose kinases in the hexokinase fam ily［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，99(4):320－330.

［2］ MAHALINGAM B，CUESTA-MUNOZ A，DAVIS E A，et al.Structuralmodel of human glucokinase in complex w ith glucose and ATP:implications for the mutants that cause hypo-and hyperglycem ia［J］.Diabetes，1999，48(9):1698－1705.

［3］ EGEA M，METON I，CORDOBA M，etal.Role of Sp1 and SREBP-1a in the insulin-mediated regulation of glucokinase transcription in the liver of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.General and Comparative Endocrinology，2008，155(2):359－367.

［4］ STOFFEL M，FROGUEL P，TAKEDA J，etal.Human glucokinase gene:isolation， characterization，and identification of two m issensemutations linked to early-onset non-insulin-dependent(type 2)diabetes mellitus［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89(16):7698－7702.

［5］ HEMRE G I，MOMMSEN T P，KROGDAHL U.Carbohydrates in fish nutrition:effects on grow th，glucose metabolism and hepatic enzymes［J］.Aquaculture Nutrition，2002，8(3):175－194.

［6］ STONE D A J.Dietary carbohydrate utilization by fish［J］.Reviews in Fisheries Science，2003，11:337－370.

［7］ CASERASA，METON I，FERNANDEZ F，etal.Glucokinase gene expression is nutritionally regulated in liver of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1493(1/2):135－141.

［8］ MOON TW.Glucose intolerance in teleost fish:fact or fiction?［J］.Comparative Biochem istry and Physiology Part B:Biochem istry ＆ Molecular Biology，2001，129(2/3):2－3.

［9］ 程汉良，夏德全，吴婷婷.鱼类脂类代谢调控与脂肪肝［J］.动物营养学报，2006，18(4):294 －298.

［10］ BLIN C，PANSERAT S，KAUSHIK S，etal.Partial molecular cloning and tissue distribution of hexokinaseⅠ cDNA in common carp［J］.Journal of Fish Biology，2000，56:1558－1561.

［11］ PANSERAT S，BLIN C，MEDALE F，et al.Molecular cloning，tissue distribution and sequence analysis of complete glucokinase cDNAs from gilthead seabream(Sparus aurata)，rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)and common carp(Cyprinus carpio)［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1474(1):61 －69.

［12］ 戈贤平，俞菊华，吴婷婷.翘嘴红鮊GK基因的克隆和序列分析［J］.水产学报，2006，30(3):410 －415.

［13］ DIEFFENBACH CW，DVEKSLER G S.PCR primer:a laboratory manual［M］.Plainview，N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.

［14］ KUMAR S，TAMURA K，NEIM.MEGA3:integrated software formolecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5(2):150 －163.

［15］ ANDREONE T L，PRINTZ R L，PILKISS J，etal.The am ino acid sequence of rat liver glucokinase deduced from cloned cDNA［J］.The Journal of Biological Chem istry，1989，264(1):363－369.

［16］ VEIGA-DA-CUNHA M，COURTOIS S，M ICHEL A，et al.Am ino acid conservation in animal glucokinases.Identification of residues implicated in the interaction with the regulatory protein［J］.The Journal of Biological Chemistry，1996，271(11):6292－6297.

［17］ PANSERAT S，FONTAGNE S，BERGOT P，et al.Ontogenesis of hexokinaseⅠ and hexokinaseⅣ(glucokinase)gene expressions in common carp(Cyprinus carpio)related to diet［J］.The British Journal of Nutrition，2001，85(6):649－651.

［18］ SOENGAS JL，POLAKOF S，CHEN X，etal.Glucokinase and hexokinase expression and activities in rainbow trout tissues:changes w ith food deprivation and refeeding［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，2006，291(3):810－821.

［19］ PANSERAT S，CAPILLA E，GUTIERREZ J，et al.Glucokinase is highly induced and glucose-6-phosphatase poorly repressed in liver of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)by a single meal w ith glucose［J］.Comparative Biochem istry and Physiology Part B:Biochem istry ＆ Molecular Biology，2001，128(2):275－283.

［20］ CAPILLA E，MEDALE F，NAVARRO I，et al.Muscle insulin binding and plasma levels in relation to liver glucokinase activity，glucosemetabolism and dietary carbohydrates in rainbow trout［J］.Regulatory Peptides，2003，110(2):123－132.

［21］ PANSERAT S，MEDALE F，BLIN C，etal.Hepatic glucokinase is induced by dietary carbohydrates in rainbow trout，gilthead seabream，and common carp［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Com parative Physiology，2000，278(5):1164－1170.

［22］ METON I，CASERAS A，FERNANDEZ F，et al.Molecular cloning of hepatic glucose-6-phosphatase catalytic subunit from gilthead sea bream(Sparus aurata):response of its mRNA levels and glucokinase expression to refeeding and diet com position［J］.Com parative Biochem istry and Physiology Part B:Biochem istry＆ M olecular Biology，2004，138(2):145－153.

［23］ FERNANDEZ F，M IQUEL A G，CORDOBA M，et al.Effects of diets w ith distinct protein-to-carbohydrate ratios on nutrient digestibility，grow th performance，body composition and liver intermediary enzyme activities in gilthead sea bream(Sparus aurata L.)fingerlings［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2007，343(1):1.

［24］ EGEA M，METON I，BAANANTE IV.Sp1 and Sp3 regulate glucokinase gene transcription in the liver of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.Journal of Molecular Endocrinology，2007，38(4):481 －492.

［25］ ENES P，PANSERAT S，KAUSHIK S，et al.Hepatic glucokinase and glucose-6-phosphatase responses to dietary glucose and starch in gilthead sea bream(Sparus aurata)juveniles reared at two temperatures［J］.Comparative Biochem istry and Physiology Part A:Molecular＆ Integrative Physiology，2008，149(1):80－86.