发酵乳酸杆菌对肉鸡胰腺和小肠消化酶活性及营养物质消化率的影响

郭元晟 闫素梅，* 张和平 付果花 史彬林

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018;2.内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018)

许多研究结果表明发酵乳酸杆菌(L.fermentum)耐酸、生长繁殖性能良好，抗逆性强，无毒、无残留、无污染等，同时对小鼠、仔猪等哺乳动物的消化功能和免疫功能有一定促进效果，因此有望成为绿色的抗生素替代品。Huang等［1］研究报道，L.fermentum对仔猪肠黏膜具有很强的吸附能力，同时具有抑制大肠杆菌K88黏附的作用。在仔猪饲粮中添加L.fermentum可以显著提高仔猪的营养物质消化率、日增重与饲料转化率，免疫功能也明显改善［2－3］。淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶是肉鸡重要的消化酶，其活性直接影响肉鸡的营养物质消化吸收进而影响消化功能［4］。Jin等［5］报道在饲粮中添加0.1%的嗜酸乳酸杆菌，肉鸡小肠内容物淀粉酶活性显著增高;庞晖等［6］的研究也得出了相似的结果。在肉鸡饲粮中添加乳酸菌和芽孢杆菌，可刺激肉鸡胰腺淀粉酶和蛋白酶的分泌，小肠淀粉酶、蛋白酶和糜蛋白酶的活性分别提高32%、15%和18%［7］。也有研究表明，即使同一菌属的不同菌株对动物消化酶活性的影响也不同［8］。研究也表明，在肉鸡饲粮中添加保加利亚乳酸杆菌能够提高营养物质的消化率［9］;在鸡饲粮中添加0.2%含乳酸菌及双歧杆菌等多种高活力菌的复合益生菌(活菌总数≥50 CFU/g)后，与对照组相比粗蛋白质消化率、干物质消化率、能量消化率分别提高了5.72%、8.76% 和 6.85%［10］。在断奶仔猪饲粮中添加0.25%的复合乳酸杆菌(活菌数4×108CFU/m L)可以显著提高断奶仔猪的平均日采食量及饲粮粗脂肪的表观消化率，极显著提高胰脏和十二指肠食糜脂肪酶和淀粉酶活性，说明乳酸杆菌在仔猪消化酶活性及养分表观消化率等方面具有显著的促进作用［11］。这些研究结果提示嗜酸乳酸杆菌和芽孢杆菌对动物的消化酶活有一定促进效果，进而促进了营养物质的消化，增强了动物的消化功能。L.fermentum F-6是从菌种库 90株L.fermentum中初步筛选出的一株耐酸、耐胆盐、抗菌活性较强的L.fermentum，但关于L.fermentum F-6对动物的消化功能是否有影响，研究报道极少。鉴于此，本文从肉鸡消化道酶活和回肠营养物质消化率的角度研究不同水平L.fermentum F-6对肉鸡消化功能的影响，为肉鸡生产中科学添加L.fermentum F-6提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

L.fermentum F-6是从菌种库90株 L.fermentum中初步筛选出的一株耐酸、耐胆盐、抗菌活性较强的L.fermentum，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供，有效活菌总数为2.37×1011CFU/g。肉鸡苗由内蒙古农牧业科学院种鸡场提供。

1.2 试验动物与试验设计

试验采用单因子完全随机试验设计方法，选择1日龄体重相近、健康的爱拔益加(AA)肉仔鸡240只(雌雄各占1/2)，称重后随机分为4个组，其中1个对照组和3个L.fermentum组(F1、F2、F3组)。对照组肉鸡不饲喂L.fermentum F-6，F1、F2、F3组通过饮水添加L.fermentum F-6，添加水平分别为2×105、2×106和1×107CFU/m L，每组6个重复，每个重复10只鸡，各组鸡的初始体重经方差检验差异均不显著(P＞0.05)。试验期42 d，分2个阶段饲养(1～21日龄、22～42日龄)。

1.3 基础饲粮组成与饲养管理

试验以玉米和大豆粕为主要原料，按照肉鸡生长发育阶段，即1～21日龄和22～42日龄2个阶段的不同需要来配制基础饲粮，饲粮组成及营养水平见表1，所有试验饲粮均以粉状形式饲喂。鸡笼内采用红外线加热装置自动控温，试验期内采用每天23 h光照和1 h黑暗的光照及机械通风制度，鸡舍室温在前3天内保持33℃，以后每周降低3℃，直到舍温达到24℃后保持恒定不变。试验鸡自由采食、饮水。试验期内每天人工清粪1次。按照常规的免疫程序进行免疫，在整个试验期内各组的试验条件要保持一致。

1.4 样品的采集与制备

1.4.1 样品的采集

在试验开始后于42日龄早晨称重后从每个重复中随机抽取空腹鸡(体重接近平均体重)2只，采用颈静脉放血的办法处死，立即放于冰盘上打开腹腔，小心剥离，摘取胰腺，剥除脂肪组织和结缔组织后用锡箔纸包好，立即放入液氮中快速冷冻后，转入－20℃低温冰箱冻存备用。同时迅速地在冰浴上剪取十二指肠、空肠、回肠的中上游部位7 cm左右，小心剪开后用预冷生理盐水将黏膜上的食糜冲洗干净用锡箔纸包好，放于液氮中快速冷冻后转入－70℃低温冰箱中冻存，用于消化酶活性的测定。收取回肠末端中的食糜于离心管中，盖紧盖后立即贮于－20℃下低温保存。同时饲料样品于自封袋中，扎紧袋口于4℃保存备用。屠宰试验结束后将食糜样品置于65℃干燥箱中烘干制备风干样，粉碎混匀后装入自封袋于4℃冰箱中冷藏保存，用于消化率的测定。

1.4.2 分析样的制备

1.4.2.1 胰腺上清液的制备

取出冷冻的胰脏，在未完全解冻前从头、体、尾3个部位取0.5 g左右的胰脏，用解剖刀将其切成碎片，用分析天平称重。按质量体积比1∶4加入4℃的匀浆介质溶液匀浆1 m in，整个过程都在冰浴中进行。充分研磨后将匀浆液倒入离心管，于4℃、2 500×g下离心15 m in，取上清液分装成3份贮存于－30℃冰柜中备用。

1.4.2.2 小肠黏膜上清液的制备

取出冷冻的小肠组织，放于4℃冰箱中解冻，待完全解冻后取出放于保鲜膜上，用载玻片刮取黏膜0.5 g左右，准确称重后按质量体积比1∶4加入4℃的匀浆介质匀浆30 s，整个过程都在冰浴中进行。充分研磨后将匀浆液倒入离心管，于4℃、2 500×g下离心15 m in，迅速将上清液分装成3份贮存于－30℃冰柜中备用。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.5 试验仪器

试管、混匀器、移液器、恒温水浴锅、计时器、低温离心机(Eppendorf)、凯氏定氮仪、1281全自动氧弹式能量测定仪、紫外可见光分光光度计、Thermo Scientific Multiskan Ascent酶标仪。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 消化酶活性的测定

胰腺组织与小肠黏膜中淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性使用试剂盒测定。试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，测定方法参照说明书进行。十二指肠糜蛋白酶活性采用酶联免疫法(ELISA)进行测定，试剂盒由ADL公司提供，方法参照说明书进行。

1.6.2 回肠营养物质表观消化率的测定

采用内源指示剂法测定肉鸡回肠粗蛋白质和能量的表观消化率。其中，回肠食糜及饲料样品中粗蛋白质与总能的含量采用常规营养成分分析法;内源指示剂(4 mol的盐酸不溶灰分)参照Vogtmann等［12］的方法进行测定。计算公式为:饲料某养分消化率(%)=100－［(饲料中指示剂含量/粪中指示剂含量)×(粪中某养分含量/饲料中某养分含量)］×100。

1.7 试验数据处理

本试验数据利用SAS 9.0软件的ANOVA程序进行统计分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 L.fermentum F-6对肉鸡淀粉酶活性的影响

表2结果表明，添加L.fermentum F-6可显著提高肉鸡空肠和胰腺组织淀粉酶活性(P＜0.05)，其中F2组肉鸡空肠淀粉酶活性显著高于对照组(P ＜0.05)，比对照组提高 74.34%，F1组和 F3组空肠淀粉酶活性与对照组相比有一定增强趋势，但差异不显著(P＞0.05);F1组和F2组胰腺组织淀粉酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，以F2组效果较好，比对照组提高65.42%。添加L.fermentum F-6对肉鸡十二指肠和回肠淀粉酶活性均无显著影响(P＞0.05)。

表2 L.fermentum F-6对肉鸡淀粉酶活性的影响Table 2 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of am ylase in broilers U/mg prot

2.2 L.fermentum F-6对肉鸡脂肪酶活性的影响

表3结果表明，添加不同水平的L.fermentum F-6对肉鸡小肠黏膜及胰腺组织脂肪酶活性的影响均不显著(P ＞0.05)。

表3 L.fermentum F-6对肉鸡脂肪酶活性的影响Table 3 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of lipase in broilers U/mg prot

2.3 L.fermentum F-6对肉鸡小肠黏膜及胰腺组织胰蛋白酶活性的影响

表4结果表明，添加L.fermentum F-6可显著提高肉鸡空肠和回肠胰蛋白酶活性(P＜0.05)，尤其以F2组较好，分别比对照组提高41.61%和33.43%(P ＜0.05);添加 L.fermentum F-6对肉鸡十二指肠和胰腺组织胰蛋白酶活性的影响均不显著(P ＞0.05)。

表4 L.fermentum F-6对肉鸡胰蛋白酶活性的影响Table 4 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of trypsin in broilers U/mg prot

2.4 L.fermentum F-6对十二指肠糜蛋白酶活性的影响

表5结果表明，添加L.fermentum F-6可显著提高肉鸡十二指肠糜蛋白酶活性(P＜0.05)，其中F2组显著高于对照组(P＜0.05)，比对照组提高56.08%;F1组和F3组与对照组差异不显著，但有增强的趋势(P ＞0.05)。

表5 L.fermentum F-6对肉鸡十二指肠糜蛋白酶活性的影响Table 5 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of chymotrypsin in duodenum of broilers ng/mg prot

2.5 L.fermentum F-6对肉鸡回肠粗蛋白质和能量的表观消化率的影响

表6结果表明，添加L.fermentum F-6可显著提高肉鸡回肠粗蛋白质和能量的表观消化率(P＜0.05)，尤以F2组效果较好，分别比对照组提高23.56%和 18.54%(P ＜0.05)。

表6 L.fermentum F-6对肉鸡营养物质消化率的影响Table 6 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the nutrient digestibility in broilers %

3 讨论

3.1 L.fermentum F-6对肉鸡消化酶活性的影响

淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶是肉鸡重要的消化酶，其活性直接影响肉鸡的生产性能［4］。本试验结果表明，添加不同水平的 L.fermentum F-6对空肠和胰腺组织淀粉酶活性、空肠和回肠胰蛋白酶活性及十二指肠糜蛋白酶活性有显著的促进效果，尤其是以添加水平为2×106CFU/m L的F2组效果最好。结果也表明，对于添加水平为 2×105CFU/m L的 F1组、1×107CFU/m L的F3组，上述酶活性虽然与对照组相比有不同程度的增强，但与F2组相比呈降低趋势。这些试验结果提示适量的L.fermentum F-6可以提高肉鸡胰腺和小肠的淀粉酶和蛋白酶活性，提高肉鸡的消化功能，而且促进效果存在水平依赖效应，过低或过高的添加水平均削弱了消化酶的活性，其原因尚不清楚，有待于进一步研究。

目前，关于乳酸杆菌对消化道酶活性影响的研究主要是针对嗜酸乳酸菌和芽孢杆菌进行的，而且研究结果不尽一致。王国霞等［13］研究表明饲喂嗜酸乳酸杆菌可以显著提高虾胰腺组织和肠道黏膜中蛋白酶和淀粉酶活性。Jin等［5］研究报道，给肉鸡饲喂嗜酸乳酸菌可以显著提高肉鸡小肠黏膜淀粉酶活性，但对脂肪酶活性无显著影响。Collington等［14］研究表明，饲喂乳酸菌可以显著提高猪肠道中淀粉酶活性，但对脂肪酶活性无显著影响，这些报道与本试验结果相一致。然而，王志祥等［11］报道，在饲粮中添加 0.25% 的乳酸杆菌(有效活菌数为4×108个/m L)可显著提高断奶仔猪胰脏和十二指肠食糜中脂肪酶的活性。邢广林［15］研究表明，肉鸡饲粮中添加0.2%的芽孢杆菌和乳酸菌复合微生态制剂能显著提高十二指肠和胰脏内胰蛋白酶和淀粉酶的活性，但对糜蛋白酶活性影响不显著。张晓梅等［16］使用地衣芽孢杆菌、乳酸杆菌等混合制成的微生态制剂饲喂雏鸡，能够显著提高雏鸡肠道内蛋白酶和脂肪酶活性。造成以上差异的因素较多，如菌株的特性、应用水平、宿主生理状态以及环境因素等。

关于L.fermentum F-6对肉鸡消化道酶活的影响及其作用机理的研究尚未见资料报道。张晓梅等［16］报道，给20日龄后的雏鸡饲喂不同类型的益生素可使血清和肠道中一些消化道酶的活性显著升高，这可能与摄入的细菌在消化道内定植、生长并繁殖，从而影响肠道微生物群落，其中的有益菌产生一些维生素、酶类、短链脂肪酸等有益物质促进肠道酶的分泌有关。张春杨等［17］在肉鸡饲粮中添加益生菌剂，发现肉鸡消化道内容物中的蛋白酶活力显著提高，提高幅度最高可达21.76%，这可能是因为益生菌到达消化道内能够分泌并活化大量蛋白酶的缘故［18］。Jin等［19］研究发现，从雏鸡消化道分离出的12株乳酸杆菌都能够分泌淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，乳酸菌在胃肠道所产生的有机酸有利于补充动物因应激而导致的胃酸分泌不足，有利于消化道内胃蛋白酶原的激活，这2种作用都有利于消化道酶活性的提高。Yang等［20］用乳酸菌和双歧杆菌饲喂大鼠，可以提高其消化酶活性，其机理可能是有益菌通过改善宿主胃肠道环境增加了细菌酶的分泌以及益生菌可以促进肠道黏膜的生长。

3.2 L.fermentum F-6对肉鸡粗蛋白质和能量表观消化率的影响

有研究表明，在育肥猪饲粮中添加乳酸杆菌能够提高蛋白质的消化率［21］。王志祥等［11］在断奶仔猪基础饲粮中添加0.25%乳酸杆菌液体制剂(活菌数为4×108个/m L)可显著提高饲粮粗脂肪表观消化率，粗蛋白质、钙及总磷表观消化率也有提高的趋势;楚渠等［10］的试验结果表明，在鸡饲粮中添加0.2%的含芽孢杆菌、乳酸菌及双歧杆菌等多种高活力菌的复合益生菌(活菌总数≥50 CFU/g)，与对照组相比粗蛋白质消化率、干物质消化率、能量消化率分别提高5.72%、8.76%和6.85%。本试验研究结果与上述研究结果相似，添加L.fermentum F-6可显著提高肉鸡回肠粗蛋白质和能量的表观消化率，尤以添加水平为2×106CFU/m L的F2组效果最好。结果提示适量的L.fermentum F-6可以提高肉鸡回肠粗蛋白质和能量的表观消化率，而且提高的效果存在水平依赖效应，过低或过高的添加水平会均削弱其对粗蛋白质和能量表观消化率的增强效果。这些研究结果与酶活性的研究结果相吻合，这进一步说明了L.fermentum F-6对肉鸡消化功能有显著的促进作用，且促进效果呈水平依赖性。由此也推测，L.fermentum F-6对肉鸡营养物质消化功能的增强可能是由于L.fermentum F-6可增加肠道的消化酶活性，进而有利于饲料中营养物质的降解，引起营养物质消化率的提高。

4 结论

①添加L.fermentum F-6对肉鸡空肠和胰腺组织淀粉酶活性、空肠和回肠胰蛋白酶活性及十二指肠糜蛋白酶活性有显著的增强效果，尤以添加水平为2×106CFU/m L的F2组效果最好。

②添加L.fermentum F-6可显著增加肉鸡回肠粗蛋白质和能量的表观消化率，增强肉鸡的消化功能，且增强效果与添加水平有关，添加水平为2×106CFU/m L时效果最明显。

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