羰氨缩合尿素的营养价值评价

李兴伟 薛 白* 王之盛 徐世晓 王基恒 李占锋

(1.四川农业大学动物营养研究所，雅安 625001;2.中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810000)

近年来由于蛋白质饲料价格上涨，反刍动物养殖成本也在逐年升高，而利用尿素等非蛋白含氮化合物(NPN)替代反刍动物饲粮中的蛋白质饲料原料对缓解这一状况效果明显［1］。但尿素在瘤胃微生物脲酶的作用下水解快，氨的释放速度往往超过瘤胃微生物的利用速度，造成相当数量的氨进入血液。当血液氨浓度超过肝脏的解毒能力时，就会引起动物机体氨中毒。因此，实际生产中尿素的应用在很大程度上受到限制。农业废弃物如蔗渣、玉米秸秆、玉米芯、花生及燕麦壳聚戊糖含量丰富，水解加热时聚戊糖形成羰基，羰基与尿素反应形成缓释性氮源［2］，从而改善含尿素饲粮的适口性，减缓尿素释氨速度，降低瘤胃内游离氨的浓度，防止氨中毒的发生。Higgns等［3］利用紫花苜蓿、玉米和酰胺溶液(尿素、缩二脲及甲酰胺)在催化剂作用下产生多糖类的酰胺化合物，施用于反刍动物，提高了非蛋白含氮化合物的利用效率;梁致远等［2］用玉米芯作基质，添加尿素，在硫酸溶液作催化剂情况下，96%尿素与羰类结合，这类化合物可以在瘤胃内平缓的释放氨氮(NH3-N)，减少反刍动物氨中毒。本试验是在前人研究的基础上结合以往纤维质类材料制作缓释尿素的经验，化学合成了1种新型的缓释尿素产品——羰氨缩合尿素(carbonyl-am ino urea，CAU)，拟首先利用体外培养技术研究CAU释放NH3-N的速度，而后进一步利用藏羊为动物模型，分别采用豆粕(SBM)、磷酸脲(UP)和CAU配制3种等能等氮饲粮，综合评价CAU的营养价值，为CAU在反刍动物饲养中的有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

1.1.1 CAU释氨速度的评定(体外法)

用体外培养技术，通过与UP和SBM的释氨速度进行比较，评定CAU的释氨速度。本试验设置2个对照组和1个试验组，每组各设6个重复，对照组为SBM组和UP组，试验组为CAU组，按照所加各试剂等能等氮的原则，分别称取SBM、UP 和 CAU(200 ±1.0)mg、(102.7 ±1.0)mg 和(150.6±1.0)mg放入100 m L的注射器中，并向UP组和CAU组中加入淀粉(190.3±1.0)mg平衡能量。采集瘤胃液，按 Menke等［4］方法进行体外发酵试验。分别在体外培养 1、2、4、6、8、10、14、18、24 h后终止发酵，测定培养液中NH3-N浓度。瘤胃液采自3头体况良好、体重相近［(25.00±2.00)kg］，安装有永久性瘤胃瘘管的藏羊。

1.1.2 动物试验(体内法)

本试验主要用于评定CAU对藏羊瘤胃发酵和血清生化指标的影响。选择3头体况良好、体重相近［(25.00 ±2.00)kg］，安装有永久性瘤胃瘘管藏羊作为试验动物。采用3×3拉丁方试验设计，通过比较CAU饲粮、SBM饲粮和UP饲粮对藏羊瘤胃发酵和血清生化指标的影响，综合评价CAU的营养价值。试验分3期进行，每期预试期11 d，正试期2 d，全期共39 d。在体内试验正试期的第1天，于08:00在动物颈静脉采集10 m L血液样品。在正试期的第2天，分别于08:00(食前1 h)、10:00(食后 1 h)、11:00(食后 2 h)、13:00(食后4 h)、15:00(食后 6 h)、17:00(食后8 h)、19:00(食后10 h)、23:00(食后 14 h)和第 2天03:00(食后18 h)、09:00(进食后 24 h)，用瘤胃液抽虑装置通过瘘管采集瘤胃液约100 m L，注入离心管，用以测定瘤胃液中pH、NH3-N和微生物蛋白(MCP)。

1.2 试验材料

自主研发的CAU。CAU的营养成分见表1。

表1 羰氨缩合尿素的营养成分(风干基础)Table 1 The nutrients of carbonyl-am ino urea(air-dry basis) %

1.3 试验饲粮与饲养管理

试验饲粮配制参照我国肉羊饲养标准(2004)。试验分3个组，SBM组饲喂SBM饲粮，UP组饲喂 UP(粗蛋白质含量为75.41%)饲粮，CAU组饲喂CAU饲粮。试验饲粮组成及营养水平见表2。试验动物单圈饲养，每日09:00饲喂1次(先喂精料，后喂粗料)，自由饮水。

1.4 试验指标的测定及样品的处理和分析

1.4.1 血清生化指标的测定

血液样品在4 000 r/m in下离心10 m in，分离血清，分装于EP管中，于－20℃的冰箱中保存备用。采用日本岛津全自动生化分析仪对血清中尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)进行测定，试剂盒购自成都迈克试剂有限公司。

1.4.2 NH3-N 浓度的测定

取10 m L瘤胃液在4 000 r/m in下离心10 m in，量取 0.5 m L 上清液，保存在 1.5 m L 的EP管内，然后放于－20℃冰箱内冷冻保存。采用冯宗慈等［5］的改进法，用分光光度法测定上清液中NH3-N浓度。

1.4.3 pH 的测定

在各时间点发酵终止后，用Sartorius PB－20型pH计测定瘤胃液不同时间点的pH。测定前，pH计先用与待测培养液pH接近的缓冲液(pH=6.86)进行定位，而后再用pH为4.00的缓冲液调整斜率，反复调整后，用于样品测定。

表2 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.4.4 MCP 的测定

取瘤胃液 8 m L，4℃ 20 000 r/m in离心20 m in，去上清液。采用Zinn等［6］的嘌呤法，以酵母RNA作为标准品，使用紫外分光光度计在260 nm波长下测定各样品的MCP含量。

1.5 数据统计处理

采用Excel软件整理数据，用SPSS 18.0统计软件中的GLM模型进行方差分析，均值的多重比较采用Duncan氏法进行。

2 结果

2.1 体外培养技术评定CAU释氨速度

由表3可知，在1～24 h内，CAU组和UP组的NH3-N浓度变化规律都为先升后降，而SBM组则呈缓慢上升趋势。CAU组在8 h以前各时间点的NH3-N浓度均低于UP组，高于SBM组;8 h NH3-N浓度达到最大值(42.76 mg/dL)，此时低于 UP 组 11.27%(P ＜0.01)，高于 SBM 组44.08%(P ＜0.01);8 h之后高于 UP 组和 SBM组，直到24 h与UP组持平，低于 SBM组(P＜0.01)。而 UP组 在 2 h便 达 到 最 大 值(54.44 mg/dL)，SBM 组则在 24 h出现最大值(45.28 mg/dL)。另外，CAU组的NH3-N浓度从2～24 h时 间 段 内 保 持 稳 定，在33.91～42.76 mg/dL范围内波动，而其他2组的波动范围都大于此。

2.2 CAU对藏羊瘤胃液pH的影响

由表4可知，在24 h时间内，3组瘤胃液pH变化规律相近，饲喂前瘤胃pH最高，采食后pH逐渐下降，并且都在食后6 h pH达到最低值，且差异不显著(P＞0.05)，而后又逐渐上升。CAU组、UP组、SBM组的 pH变化范围分别是6.18～6.89、6.19 ～6.94、6.11 ～6.92。

2.3 CAU对藏羊瘤胃液NH 3-N浓度的影响

由表5可以看出，在24 h内，3组瘤胃液NH3-N浓度变化规律相近，都呈“高－低－高”的变化趋势，并且都在进食后2 h达到最大值。在2 h时，CAU组瘤胃液NH3-N浓度低于UP组(P＜0.01)，高于 SBM 组(P ＜0.05)。CAU 组、UP 组和SBM组3个组的NH3-N浓度变化范围分别是:10.84 ～ 16.60 mg/dL、10.64 ～ 19.26 mg/dL 和10.92 ～14.56 mg/dL。

表3 各处理不同时间点的NH 3-N浓度Table 3 The change of NH3-N concentration in each treatmentw ith extension of time mg/dL

表4 羰氨缩合尿素对藏羊瘤胃液pH的影响Table 4 Effects of CAU on rum inal fluid pH in Tibetan sheep

2.4 CAU对藏羊瘤胃液MCP含量的影响

由表6可知，在采食后1～2 h，CAU组与UP组的MCP含量均显著高于SBM 组(P＜0.01);在采食后10 h，CAU组藏羊瘤胃液MCP的含量达到最大值，此时比UP组和 SBM组分别高4.39%(P ＞0.05)和 27.24%(P ＜0.01);综合来看，24 h内CAU组藏羊瘤胃液MCP的含量平均为17.25 mg/dL，高于 UP 组3.01%，高于 SBM 组30.45% 。

2.5 CAU对藏羊血清生化指标的影响

由表7可以看出，各组间藏羊血清中ALB、TP、BUN的含量，GOT和GPT活性均无显著差异(P ＞0.05)。

表5 羰氨缩合尿素对藏羊瘤胃液NH 3-N浓度的影响Table 5 Effects of CAU on rum inal fluid NH3-N concentration in Tibetan sheep mg/dL

表6 羰氨缩合尿素对藏羊瘤胃液MCP含量的影响Table 6 Effects of CAU on rum inal fluid MCP concentration in Tibetan sheep mg/dL

3 讨论

3.1 体外法评定CAU的释氨速度

NH3-N是饲料蛋白质和内外源尿素分解的终产物，又是微生物合成蛋白质的原料。NH3-N的浓度直接影响MCP的产量［7］。由表3可以看出，CAU组在8 h以前各时间点的NH3-N浓度均低于UP组，高于 SBM 组;24 h与 UP组持平，低于SBM组，且NH3-N浓度在2～24 h时内的变化范围更小，说明与UP组和SBM组相比，CAU组释氨速度更为平稳。李静等［8］研究表明，尿素及其衍生物饲料级缩二脲在体外短期人工瘤胃模拟培养4 h，尿素与饲料级缩二脲NH3-N浓度均呈逐渐升高趋势，尿素与饲料级缩二脲NH3-N浓度在0.5～4 h 时的变化范围分别为20.91 ～91.12 mg/dL和 21.76 ～56.56 mg/dL，并指出饲料级缩二脲释氨程度与速度显著小于尿素，而本研究CAU组氨氮浓度在前4 h的变化范围为11.60～38.12 mg/dL，释氨程度与速度小于饲料级缩二脲及尿素。由此可以看出，羰氨缩合尿素释氨速度大幅度降低，可长时间平缓的为瘤胃微生物生长提供氮源。

3.2 CAU对藏羊瘤胃液pH的影响

瘤胃pH是反映瘤胃发酵水平最基本、最重要的指标之一，对维持瘤胃内环境相对恒定起到主导作用［9］。瘤胃pH直接受唾液分泌、挥发性脂肪酸(VFA)及其他有机酸生成、吸收和排出等因素的影响［10］，其波动的根本原因取决于饲粮结构和营养水平［11］。李静等［8］以尿素和饲料级缩二脲饲粮饲喂西门塔尔牛，饲料级缩二脲饲粮的瘤胃pH在6.57～6.91范围内波动，而本研究3组饲粮对藏羊瘤胃pH的影响规律十分相似，均在采食后开始下降，6 h降到最低，然后又逐渐升高。UP组和CAU组仅在2、4及6 h高于 SBM 组，CAU组、UP组及SBM组的pH变化范围分别是6.18～6.89、6.19 ～ 6.94、6.11 ～ 6.92，均在瘤胃正常pH 范围(5.5 ～7.5)内。

3.3 CAU对藏羊瘤胃液NH 3-N浓度的影响

Hart等［12］报道反刍动物体内瘤胃微生物生长的适宜NH3-N 浓度范围为6.3～27.5 mg/dL，本研究中各组瘤胃NH3-N浓度都在此范围内。本试验3个组NH3-N浓度变化趋势与前人研究一致［13－14］，在 24 h 时间内，各组瘤胃液 NH3-N 浓度在2 h达到最大值后，UP组和SBM组均在8 h时降到最低，而CAU组则在14 h降到最低;2～14 h范围内，CAU组的NH3-N浓度波动范围小于UP组，高于SBM组，表明CAU组释氨速度较之UP组适中且平稳，与体外培养的结果一致。李静等［8］用体内法研究饲料级缩二脲的有效性，结果发现尿素组与饲料级缩二脲组NH3-N浓度变化趋势一致，2组的NH3-N浓度变化范围分别为8.63 ～34.63 mg/dL和 9.67 ～23.17 mg/dL，并指出饲料级缩二脲较尿素更有利于氨利用效率的提高和安全性的提升，本研究CAU组NH3-N浓度波动范围明显低于尿素与饲料级缩二脲，结合体外法可知CAU作为一种饲料级非蛋白含氮化合物，其氨利用效率更高，安全性更可靠。

3.4 CAU对藏羊瘤胃液MCP合成的影响

瘤胃微生物是反刍动物蛋白质营养的重要组成部分，可为畜主提供所需要蛋白质的40%～60%［15］。反刍动物瘤胃微生物生长率是影响机体营养代谢状况和生产水平发挥的重要因素。本试验研究中，在前10 h CAU组的瘤胃液MCP含量增长速度高于其他2组，3组均在10 h达到最大值，且10 h之后CAU组的浓度降低速度低于其他2组;从整体来看，在24 h内CAU组藏羊瘤胃液MCP含量平均为17.25 mg/dL，高于其他2组。结合各组NH3-N浓度变化范围与MCP含量可以看出，CAU组和SBM组MCP含量在2 h内与UP组无显著差异(P＞0.05)，可以得出，UP组释氨过快，过量的氨并未被充分利用合成MCP;而CAU组MCP的含量可长时间保持较高浓度。总体上，CAU组的MCP含量也高于UP组，说明CAU组释氨速度缓慢，可长时间为瘤胃微生物合成MCP提供氮源。

3.5 CAU对藏羊血清生化指标的的影响

血清TP和ALB在一定程度上代表了饲粮中蛋白质的营养水平及动物对蛋白质的消化吸收程度［16］。血清ALB由肝脏合成，除起到维持血浆渗透压，提供机体蛋白质来源和提供能量外，还是营养物质的载体。本试验中各试验组的血清TP与ALB含量均无显著差异(P＞0.05)，说明在饲粮中添加CAU，藏羊对蛋白质的消化吸收，以及肝脏对蛋白质的合成未受不良影响。

尿素是哺乳动物体内蛋白质和氨基酸等含氮物质代谢的终产物，瘤胃内氨的浓度与BUN含量呈高度正相关，BUN浓度高低在一定程度上可以反映饲粮氮的利用效率［17］。瘤胃内氨的浓度、瘤胃MCP的合成和体内氨基酸的分解都会影响BUN的浓度。在饲粮中添加非蛋白含氮化合物，会提高瘤胃液的氨浓度，进而提高BUN的浓度。如果MCP的合成受阻，也会使瘤胃内的氨浓度升高，进而造成BUN的浓度升高［18］。本试验中，各处理间BUN浓度无显著差异(P＞0.05)，表明各处理氮代谢均处于正常水平。

GOT和GPT是动物体内2种与蛋白质代谢相关的重要酶。在瘤胃微生物利用氨合成MCP的过程中，GPT催化氨基与碳架结合生成氨基酸，GOT是体内联合脱氨基作用的关键酶，使天门冬氨酸及a－酮戊二酸转换氨基生成谷氨酸和草酰乙酸。血液中氨浓度过高时，会增加肝脏的负担，使2种酶的活性升高。CAU组的藏羊血清GPT与GOT均略低于UP组。本试验各处理GOT和GPT均处在藏羊正常生理范围内，这与前面瘤胃液NH3-N浓度处在正常范围内，不会引起大量NH3-N进入血液相一致。

试验结果显示，饲粮中添加CAU与添加SBM和 UP 比较，藏羊血清中 BUN、ALB、TP、GOT、GPT均没有显著差异(P＞0.05)，均在正常生理范围内，进一步证实饲粮中添加CAU是可行的。

4 结论

①CAU在瘤胃内的NH3-N释放速度减缓。

②CAU可以保证瘤胃内环境的相对稳定。

③CAU可长时间平缓的为瘤胃微生物提供氮源，促进瘤胃内MCP的合成。

④饲粮中添加CAU，可以提高藏羊对尿素氮的利用水平，且不会增加藏羊的肝脏负担。

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