低聚半乳糖对延边黄牛犊牛粪样菌群、血液指标及生长性能的影响

王智航 姜成哲 崔明勋 安尚泽 汪 岩 姜 贺 刘 欢 李洪龙

(延边大学农学院，延吉 133000)

肠道菌群的稳定是保障犊牛健康的第一道防线，为尽早建立完善的肠道菌群环境和犊牛免疫系统，进行营养手段的干预和调控是必要的。犊牛出生时消化道为无菌环境，开放式接受母源营养和抗体，而后随着稳定菌群环境(菌种、数目及比例相对稳定)的逐渐建立，功能完善的肠黏膜免疫屏障最终形成。由于这需要一定的时间和环境，为病原菌的定植与侵袭提供了机会，是犊牛腹泻等一些疾病的主因。因此以这一时期的犊牛为研究对象，是把握犊牛健康和保证生产效益的关键。低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)是益生素的一种，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1～7个半乳糖基。GOS的原型出现在动物的乳汁中，量很少。作用特点是作为选择性的微生物前体，在肠道中被某些细菌的β－半乳糖苷酶水解为葡萄糖和半乳糖，作为细菌复制与增殖的碳源，从而影响肠道菌群平衡。其益生原理有2种，一是某些病原菌不能利用GOS;二是有益菌利用GOS作为自身增殖的碳源，竞争性的阻止了病原菌的定植［1］。邰秀林等［2］采用低聚果糖用于1月龄以后对犊牛，王喜明等［3］采用低聚木糖用于7日龄以后的犊牛，均有一定效果。而笔者认为，犊牛出生至1月龄是肠道菌群定植和稳定环境形成的阶段，是肠道调控的关键。本试验通过调查GOS对初生犊牛粪样菌群、血液指标及生长性能的影响，探讨利用GOS作为犊牛用益生素的效果，并对犊牛出生后的肠道菌群变化及GOS的机制做一探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

GOS:纯度57%，微黄色液体，密度1.462 4 g/mL，购自广东云浮新金山生物科技有限公司。

1.2 试验动物与试验设计

选取12头初生重相近，体况良好的新生犊牛，公母各占1/2，按体重和性别随机分为3组，每组4头，于2～29日龄分别日灌服 GOS 0(对照组)、10(L 组)、15 g/d(H 组)。

犊牛出生后1～2 h保证吃到足够的初乳。试验进行前统一驱虫。犊牛和母牛在同舍饲养，每天06:00饲喂和灌服GOS。犊牛采用随母哺乳方式，根据需要自由哺乳。自由饮水，常规光照，每次饲喂后，清扫牛舍，保持牛体表的清洁。

1.3 试验方法

1.3.1 粪样采集与菌落培养

于8、15、22和29日龄晨饲前，刮取犊牛直肠末端粪样约1 g，装入灭菌后的离心管，迅速送回实验室。准确称取0.1 g粪样，用生理盐水等比稀释到不同滴度 10－5、10－7、10－9、10－11(根据培养后的菌落密度调整)。每个滴度取200μL，在准备好的平板培养基上涂菌［双歧杆菌采用BBL培养基、大肠杆菌采用伊红美蓝(EMB)培养基［4］］。所有操作均在厌氧操作台上进行的，BBL培养基上涂菌后厌氧培养箱中37℃培养48 h;EMB培养基涂菌后移至常规培养箱，有氧环境37℃培养48 h。用全自动菌落计数仪(V1型，杭州迅数科技有限公司)结合肉眼观察记录菌落数，以lg(CFU/g)表示。

1.3.2 血样采集与分析

于15和29日龄，于犊牛颈静脉分别用十二烷基四乙酸二钠(EDTA)真空管采集血液2 m L、肝素真空管采集2 m L，样本采集后送到吉林省珲春市医院，采用全自动五分类血细胞分析仪(雅培CELL－DYN 3700)测定红细胞数(RBC)、平均细胞容积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)、血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HGB)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC);采用全自动生化分析仪(雅培C8000)测定谷草转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性及血清尿素氮(BUN)含量。

1.3.3 生产性能的测定

于1和29日龄清晨空腹测定犊牛初生重和试验结束时末重，并计算平均日增重。

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 16.0进行统计分析和单因素方差分析，差异显著者用Duncan氏法进行多重比较。

2 结果

2.1 GOS对粪样菌群的影响

由表1可知，对照组犊牛粪样大肠杆菌数较为稳定，8～29日龄内无显著变化(P＞0.05)，为9.58～10.46 lg(CFU/g);各试验组随日龄增加，大肠杆菌数先增加后减少，22日龄为最高;L组随日龄的变化显著(P＜0.05)，H组变化相对缓慢;22日龄各试验组大肠杆菌数显著高于对照组(P＜0.05)，其他各日龄对照组与试验组均差异不显著(P＞0.05);29日龄对照组和L组大肠杆菌数最低，2组间差异不显著(P＞0.05)。

对照组双歧杆菌数随日龄增加而增多，变化范围7.28 ～10.15 lg(CFU/g)，22 日龄以后差异显著(P＜0.05);各试验组犊牛在各日龄双歧杆菌数均显著高于对照组(P＜0.05)，且均为22日龄达到最高;L组双歧杆菌数高于其他2组。

2.2 GOS对血液生理指标的影响

由表2可知，犊牛出生后随日龄增加RBC、HGB、MCHC降低，MCV、RDW、MCH 增加;L组15和29日龄、H组29日龄RBC显著低于对照组(P ＜0.05);MCV 不受处理的影响(P ＞0.05)，随日龄增加，L组和对照组MCV显著增加(P＜0.05);RDW 不受处理的影响(P＞0.05)，H 组和对照组RDW 随日龄显著增加(P＜0.05);HGB的变化趋势类似于RBC，15日龄L组显著低于对照组和H组(P＜0.05)，29日龄显著低于对照组(P＜0.05);MCHC 15日龄 H组、29日龄 L组和H组显著低于对照组(P＜0.05)。

2.3 GOS对血清生化指标的影响

由表3可知，试验期内AST活性和BUN含量均不受处理和日龄变化的影响(P＞0.05);ALT活性随日龄增加对照组和L组均显著增强(P＜0.05)，29日龄L组显著高于 H 组(P＜0.05)。

表1 GOS对犊牛粪样大肠杆菌和双歧杆菌数的影响Table 1 Effects of GOS on the numbers of Escherichia coli and Bifidobacteria in fecal in calves lg(CFU/g)

表2 GOS对犊牛血液生理指标的影响Table 2 Effects of GOS on blood physiological indices of calves

表3 GOS对犊牛血清生化指标的影响Table 3 Effects of GOS on serum biochem ical indices of calves

2.4 GOS对犊牛生产性能的影响

由表4可知，犊牛初生重差异不显著(P＞0.05);末重、平均日增重均为L组最高，显著高于对照组(P ＜0.05)。

表4 GOS对犊牛生长性能的影响Table 4 Effects of GOS on grow th performance of calves

3 讨论

3.1 GOS对犊牛粪样菌群的影响

犊牛消化道出生时为无菌环境，在出生的过程中细菌即开始定植，接种物多数来自于母畜产道和粪便，部分来自于外源环境。首先被转移接种到犊牛的是兼性菌，如大肠杆菌、链球菌属，这些非营养性的细菌通过生长耗氧制造出肠道内严格的厌氧环境，从而提供了营养性厌氧菌的生存条件［5］。通过本试验对照组数据可知，8日龄犊牛肠道中大肠杆菌数即达到了10.32 lg(CFU/g)，并在29日龄内变化不大;而双歧杆菌数8日龄远低于大肠杆菌数，并逐渐增多，22日龄后保持较稳定的数值，与前人研究一致。

肠道微生物区系的早期发育很大程度上依赖于摄取的食物。GOS的原型出现在动物的乳汁中，量很少，由乳腺合成，商品GOS则是聚合度不同的混合物。

GOS水解机制是细菌依靠自身的β－半乳糖苷酶将GOS水解，β－半乳糖苷酶与半乳糖基以共价键结合，并将半乳糖基转移给水，1分子的半乳糖被水解下来，GOS聚合度降低(乳糖降解产物为半乳糖和葡萄糖)［6－7］，最终形成的单糖进入小肠上皮，再进入血液参与机体代谢。

细菌增殖及GOS利用的选择性决定于2方面:一是该菌种是否有水解GOS的β－半乳糖苷酶，多数研究认为GOS不能使大肠杆菌增殖，大肠杆菌在乳糖上生长数千个酶的分子［7］，鉴于水解的相同机制，GOS可能也诱导了β－半乳糖苷酶分子的增加;二是聚合度，与聚合度为2的GOS或乳糖相比，聚合度为3或4的GOS更容易被双歧杆菌利用，所有的双歧杆菌属和乳酸杆菌属能够利用聚合度为2的GOS［8］。商品GOS成分较为不均一，是聚合度不同的混合物，在这样的混合物中，对微生物前体的增加归因于某一种糖的结构仍存在困难［9］。但这是局限于生产技术的，控制产品的聚合度、改进工艺及降低成本是实际生产中仍需改进的。

人食用GOS后盲肠中乳酸菌和双歧杆菌数量显著增加，大肠杆菌数量显著降低［10］。而拟杆菌属(包括双歧杆菌和乳酸菌等)和大肠杆菌是最具免疫原性的共生菌［11］。因此，GOS是否能够使大肠杆菌增殖存在争议。

犊牛的肠道处于发育过程，应将微生物共生、竞争以及环境变化作为整体来研究。本试验中大肠杆菌数在8日龄试验组均低于对照组，而在15、22和29日龄均高于对照组，可能的原因有2方面:一是GOS可以被大肠杆菌所利用，所以出现22日龄前数量的增加;二是犊牛时期肠道非严格厌氧环境制约了双歧杆菌的生长，而GOS被大肠杆菌等所利用，22日龄到达厌氧环境后，双歧杆菌的生长优势才显现出来。29日龄试验组双歧杆菌数均显著高于对照组，而使大肠杆菌数保持在和对照组无显著差异。表明GOS改善了肠道菌群平衡，使双歧杆菌在数量有显著提高，并在比例上成为优势菌群。

3.2 GOS对犊牛血液指标及生长性能的影响

血液组分的变化是考察犊牛的健康和福利水平的标准。关于犊牛出生后的红细胞及其组分的变化前人得出了较为一致结果:1周龄开始犊牛RBC和 HGB降低［12］，且 HGB随 MCHC降低而降低［13］。观察对照组结果得出的规律如下:单位体积内，随日龄增加红细胞数量减少(RBC降低)、体积(MCV)增大、大小逐渐不一致(RDW 升高);由于细胞浓度的降低，单位体积内的血红蛋白含量(HGB)及其在红细胞中的浓度(MCHC)也随之降低，而单个红细胞中血红蛋白含量(MCH)增加。

红细胞数目减少和组分变化会导致动物贫血。血液通过肺时红细胞通过血红蛋白携带氧，随氧释放到全身的组织和器官。幼年动物易发贫血，对照组中RBC和HGB减少均表明犊牛即将面临或正在面临这样的危机，据Bomba等［14］报道犊牛贫血临界期为3～5周龄，原因是较高的生长速度和造血底物的不足间的不平衡。

生长期的犊牛血液指标受饲粮和饲养管理的影响很大［15］。犊牛灌服GOS的作用结果是:RBC和HGB降低(其中 L组显著低于对照组，P＜0.05)，MCHC 显著提高了(P ＜0.05)。RBC 和HGB的变化可能同样是由于较高的生长速度引起的，可以从生长性能的试验组优于对照组得到佐证;而MCHC的升高推测是GOS引发的效果，机制尚不清楚，但可以说明单个红细胞携氧能力显著提高。MCHC 值为25.70～37.33 g/dL，与Bam i等［16］报道荷斯坦犊牛的值接近。本试验中灌服GOS的犊牛，更易面临RBC少和HGB低型的贫血，但单个红细胞的携氧能力有所提高，可缓解该型贫血。

ALP是用于诊断骨和肝功能紊乱的膜结合酶，成骨细胞活性，生长动物的ALP活性显著高，因此在幼龄动物中，ALP活性高低可以反映出动物的生长快慢，本试验中L组为最高，与生长性能L组最好相一致。

BUN可以反映动物蛋白质代谢，GOS饲喂犊牛BUN含量增加，但差异不显著，可能是由于GOS在肠道内使有益菌增值，菌体蛋白含量增加，而等于增加了动物吸收的蛋白质源。

犊牛饲喂GOS后提高了末重和平均日增重。从各项数据剖析这一结果，应该是GOS优化了肠道菌群，使双歧杆菌成为优势菌，而双歧杆菌发挥其作为益生菌的作用，引发犊牛机体的生理及免疫功能的变化，最终提高了犊牛的生长性能。L组生长性能最好，可能是由于高剂量GOS不能完全被利用，β－半乳糖苷酶的底物将其合成了更高聚合度的GOS，导致利用率的降低，同L组菌群作用效果最佳相印证，与生理生化指标变化相一致。

综合以上，GOS可以改善犊牛肠道菌群环境，使双歧杆菌成为优势菌群，提高动物生长速度，但也因高生长速度引发造血原料的不足而使动物更易贫血。

本试验采用完全随母哺乳的饲喂方式，以考察GOS单因素的作用效果，而在实际生产中如采用营养更为全面的代乳粉，通过外源补充方式可以避免本试验中的造血原料的不足。

4 结论

①初生犊牛饲喂GOS可影响肠道菌群平衡，使双歧杆菌成为肠道优势菌。

②初生犊牛饲喂GOS可提高生长速度，而相对的造血原料的不足加重，但可以缓解低MCHC型贫血的发生。

③在本试验条件下，添加10 g/d效果较好。

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