脑胶质瘤细胞体外原代培养化疗药物敏感性研究

李 剑 郑莉莉 王建祯(通讯作者)

1)河南科技大学第一附属医院 洛阳 471003 2)中国人民武装警察部队总医院神经外科 北京 100039

脑胶质瘤起源于神经外胚层,是颅内发病率最高、最难治愈的恶性肿瘤,约占所有颅内肿瘤的35%～61%[1]。由于大多数脑胶质瘤呈浸润性生长,与周围正常脑组织分界不清,单纯手术无法完全切除,手术后辅助化疗能明显提高脑胶质瘤的治疗效果。化疗效果与脑胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性有非常密切的关系[2],本研究采用M TT法检测化疗药物对胶质瘤原代培养细胞的敏感性,并根据试验结果初步筛选化疗药物、预测临床化疗效果,以期为每个胶质瘤患者制定最有效的个体化化疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料 80例标本均取自北京武警总医院神经肿瘤外科在2009-07～2010-10手术切除的新鲜脑胶质瘤标本,均由经验丰富的神经外科主刀医师取材,病理诊断由北京武警总医院病理科依据WHO神经系统肿瘤分类与分级标准(2000)作出。其中胶质瘤III级48例,胶质瘤IV级32例;男51例,女29例;年龄16～72岁,平均39.5岁。

1.2 主要试剂和化疗药物

1.2.1 主要试剂:含15%小牛血清的RPMI-1640培养基(Gibico公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、MTT液(Sigma公司)、二甲基亚砜(西安化学试剂厂)、胰蛋白酶(北京鼎国生物技术有限责任公司)、注射用青霉素G钠(哈尔滨制药总厂)、链霉素(河北华北制药有限公司)。

1.2.2 化疗药物:长春新碱(VCR)、顺铂(DDP)、尼莫司汀(ACNU)、替莫唑胺(TMZ)、替尼泊甙(VM-26)。其血浆峰浓度(PPC)分别为0.57μ g/mL、0.97μ g/mL、3.67μ g/mL、5.95μ g/mL、3.50μ g/mL,5种药物均以血浆峰浓度(PPC)为基点用生理盐水稀释成5种不同的浓度(见表1),PPC按公式Log(PPC)=-0.788+(0.755×log(LD50))[3]计算。

表1 5种化疗药物的配制浓度(μ g/mL)

1.3 胶质瘤细胞的分离培养 在手术过程中切除的新鲜肿瘤无菌标本中挑选鱼肉状组织,用生理盐水清洗,去掉血液、坏死及电凝过的组织,放入无血清的RPMI-1 640培养液中并立即送实验室;在超净台中用眼科剪等器械进一步剔除坏死组织和血凝块,用含有青霉素和链霉素的不含血清的RPMI-1640培养液反复冲洗肿瘤组织,直至培养液透明,用眼科剪将肿瘤标本剪成糊状,用吸管轻轻吹打混匀;然后把混匀的肿瘤组织移至离心管,加适量的胰蛋白酶,37℃水浴振荡1 h,离心后弃除上清液;加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液,然后重悬,之后用细胞滤器过滤悬液;再次离心,弃除上清并加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬;将肿瘤细胞悬液接种于96孔板中,每孔180μ L,将其放入37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养待用。

1.4 M TT法检测 上述96孔板中的肿瘤细胞悬液在37℃、5%CO2,饱和湿度的条件下培养24 h后每个孔中加入20 μ L不同浓度的各种抗肿瘤药物,使最终体积为200 μ L,每个条件均设3个复孔,同时设对照组。在培养箱中再培养72 h,然后每个孔中加入M TT20 μL,继续培养4 h,用快速翻板法弃去上清,每孔内加入二甲基亚砜100μ L,充分振荡,直至甲瓒结晶充分溶解后用酶标仪(选择570 nm波长)检测OD值。取3孔OD值平均数根据下列公式计算细胞生长抑制率:抑制率(IR)=(1-实验组OD值/无药组OD值)× 100%。抑制率(IR)在50%以上认为对该药敏感,IR低于50%归入耐药。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行统计学处理。各种化疗药物敏感率差别的假设检验用χ2检验和校正χ2检验,检验标准为P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤细胞原代培养中肿瘤细胞的生长状况 80例恶性脑胶质瘤标本进行原代培养,其中培养失败16例,细菌污染导致培养失败的有10例标本,其余6例失败原因不明确。培养成功的64例标本中胶质瘤Ⅲ级42例,Ⅳ级22例;男40例,女24例。肿瘤细胞刚接种时以圆形、三角形及多角形为主,以后梭形细胞逐渐增多,直至以梭形为主,细胞大小不一,形态多样,可见不规则形细胞,细胞突起较小,向四周伸展,可见多核、巨核细胞;72 h后细胞的突起变得非常明显,呈星形、放射状或不规则形,细胞体积也较前明显增大。

2.2 抗肿瘤药物在血浆峰浓度(PPC)下对64例培养成功的标本的抑制情况 见表2、3。以IR＞80%为高度敏感,其例数分别为:VCR 0例,DDP为10例,ACNU为14例,TMZ为11例,VM-26为16例;以IR＞50%为敏感,其敏感率从大到小依次为:VM-26＞ACNU＞TMZ＞DDP＞VCR;经χ2检验各种化疗药物敏感性之间差异有统计学意义(χ2= 46.1,P＜0.05)。

表2 各种化疗药物敏感例数比较

表3 64例标本对各种化疗药物敏感率比较 [例(%)]

3 讨论

脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,化疗在脑胶质瘤的综合治疗中的作用越来越受到重视,尽管化疗的手段越来越先进,通过药物打开血脑屏障、动脉内化疗以及瘤腔内化疗均可使化疗药物有效通过血脑屏障,但耐药问题一直无法取得较好的解决,脑胶质瘤的临床疗效始终没有突破性的进展。胶质瘤细胞的原代培养+药敏试验能在化疗前了解胶质瘤细胞对于不同化疗药物的敏感性,可以为每个患者制定个体化的化疗方案,避免无效化疗,减少不必要的不良反应,提高化疗效果[4-5]。

肿瘤细胞的原代培养是通过手术等方法直接从患者的肿瘤组织中取得标本,然后按步骤进行的培养。所取的肿瘤标本包含了肿瘤细胞的各种信号,这样培养出来的肿瘤细胞与在体肿瘤细胞的真实状态几乎完全一致,所以在此基础上进行的化疗药物敏感试验符合胶质瘤临床化疗的实际情况,可以很好的指导临床化疗。在胶质瘤细胞原代培养时可以详细观察其生长特性,肿瘤恶性程度越高,细胞生长速度也越快,这与在体肿瘤的生长特性相同。因此,在培养过程中肿瘤细胞的生长活力可作为肿瘤恶性程度的一个标记,观察其生长特性甚至有可能成为判断肿瘤级别的新标准[6]。

MTT法最早是由Mosmann[7]在1983年时首先报道的体外化疗药物敏感试验方法,具有操作简便、试验快速、费用低、对实验室条件要求不高、不使用同位素等诸多优点,迅速成为国内外学者进行体外化疗药物敏感试验的最常用的方法,为推进肿瘤个体化化疗奠定了基础。这种方法在投入应用后的30 a年时间里不断得到改进和优化,其测定结果与临床实际化疗的符合率也逐年得到提高,现今总体符合率已经可以达到74%～90%[8]。M TT法能较好的反映各种化疗药物对胶质瘤的敏感性,尤其是阴性结果与临床实际化疗的结果基本相符,这足以为医生制定临床个体化化疗方案提供有用的参考,帮助医生选择有效的化疗药物,设计合理的化疗方案,避免使用体外药敏试验中的耐药药物,从而避免无意义甚至有害的化疗。

本研究选用了目前国内外胶质瘤临床化疗方案中最常用的5种化疗药物。药敏试验结果示:以抑制率(IR)＞50%为敏感标准,五种药物对恶性脑胶质瘤的敏感率依次为VM-26＞ACNU＞TMZ＞DDP＞VCR,结果显示恶性脑胶质瘤对VM-26、ACNU、TMZ较敏感,对VCR敏感性最差。由于脑胶质瘤组织类型繁多,生物学特性各不相同,导致脑胶质瘤同一个体对不同化疗药物的敏感性和不同个体对同一种化疗药物的敏感性均不同。本研究结果也发现了相同的现象,如对恶性脑胶质瘤敏感率比较高的的化疗药物如VM-26、ACNU、TMZ,也存在对其很不敏感的个体;而对恶性脑胶质瘤敏感率很低的化疗药物如VCR亦存在对其敏感性很高的个体。这一结果充分说明了在恶性脑胶质瘤化疗前做体外药敏试验,选择对不同个体敏感的化疗药物进行个体化化疗的必要性。

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