甲状腺素、胰高血糖素和表皮生长因子对肉鸡小肠Ⅰ型肽转运载体mRNA表达量的影响

郑爱娟 刘国华 董晓玲 李 勇 陈桂兰

小肽是氨基酸吸收的主要形式，饲粮中的大部分氨基酸是以小肽的形式通过依赖于H+的Ⅰ型小肽转运载体(PepT1)在小肠内被吸收。研究表明，动物小肠(或肠细胞)对肽的吸收受饲粮和营养［1-6］、饥饿［7-9］、肠道损伤［10-11］、烧伤［12］、缺氧［13］、昼夜变化［14］等多种因素的影响，其中大部分因素是通过影响PepT1 mRNA表达而起作用。至今尚未详细了解其作用途径，但鉴于多种激素和活性因子都在物质跨膜转运中发挥着配体(第一信使)作用，因此研究激素和活性因子对PepT1 mRNA表达的影响将有助于揭示肽转运调控的生理和生化机制。目前已经报道了胰岛素［15-17］、生长激素［12-13］、表皮生长因子(EGF)［15，18］、肾上腺素受体激动剂［19］、瘦素［20］和三碘甲状腺原氨酸(T3)［21］对肽转运的影响，并对肽转运系统的调控机制进行了初步探讨。但现有的研究报道大部分是以哺乳动物细胞或转基因细胞为模型，而以禽类为动物模型的研究尚不多见。本试验拟通过研究甲状腺素、胰高血糖素(pancreas glucagon，PG)和EGF对肉鸡小肠PepT1 mRNA表达的影响，为探讨肽转运载体调控机制，进一步揭示肉鸡对小肽的吸收转运机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

左旋甲状腺素钠(T4，天津赫素制药有限公司)、PG(Sigma Aldrich公司)、EGF(Sigma Aldrich公司)、甲巯咪唑(methimazole，北京双桥制药公司)。

1.2 试验动物及饲养管理

选用50只1日龄健康雄性肉仔鸡，按常规饲养管理至25日龄，为预试期。期间自由采食玉米-豆粕型饲粮，自由饮水，24 h光照。1日龄注射接种马立克氏疫苗，7日龄滴鼻接种新城疫弱毒-肾传支二联疫苗。

1.3 试验设计

预试期后，从上述肉鸡中选择体重无差异的25日龄雄性肉仔鸡30只，分为5组，每组6只鸡，分别接受不同激素处理，每天1次，连续5 d。对照组、EGF组、PG组分别皮下注射蒸馏水0.20 mL/kg、EGF 0.03 mg/kg、PG 0.10 mg/kg;T4组、TH 组分别灌服 T4330.00 μg/kg、甲巯咪唑(抗甲状腺药物)25.00 mg/kg，同时皮下注射蒸馏水 0.20 mL/kg。

T4参照大鼠甲亢模型［22］的剂量给药，PG参照大鼠外源PG试验模型［23］的剂量给药，EGF参照多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠模型治疗有效剂量［24］给药，甲巯咪唑参照甲状腺功能减退症大鼠模型［25］的剂量给药。

试验鸡接受最后1次处理12 h后采血，制备血清;乙醚麻醉后宰杀，取十二指肠、空肠、回肠中段各1 cm，用冷生理盐水冲洗肠段后液氮速冻，放入超低温冰箱保存待测。

1.4 指标及测定方法

1.4.1 血清 T3、人表皮生长因子(h-EGF)和 PG含量测定

血清T3、h-EGF和PG含量分别采用T3放免试剂盒(HY-03)、h-EGF放免试剂盒(HY-058)和PG放免试剂盒(HY-039)测定。试剂盒均为北京华英生物技术研究所产品。计数器采用GC-911型γ放免计数器(中国科大光电仪器中佳分公司)。

1.4.2 小肠PepT1 mRNA表达量测定

采用离心柱型总RNA提取试剂盒(RNAultra，北京天为时代科技有限公司产品)提取肠组织总RNA，然后进行反转录。参考 PepT1基因［AY029615(2 914 bp)］序列设计特异性引物，上游引物为:5'-TAGACTGGGCAAGCGTCTT-3'，下游引物为:5'-TTTGCAACGACGACGAGAA-3'，产物长度为347 bp;内参基因β-肌动蛋白(β-actin)上游引物为:5'-TGAACAAGCCCAGAGGTTT-3'，下游引物为:5'-ATCTAAGAACGGATACCTCAGG-3'，产物长度为649 bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

使用PCR仪(Gene Amp PCR system 9700型，美国Applied Biosystem公司)进行PCR扩增。反应体系为:cDNA模板和Taq DNA聚合酶各1μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，MgSO4(100 mmol/L)0.25 μL，上 下 游 引 物(10μmol/L)各1μL，加无菌蒸馏水至50μL。

扩增条件为:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，29 个循环，72℃延伸5 min。溴化乙锭染色，电泳仪(DYY-Ⅲ31A型，北京市六一仪器厂)电泳，紫外凝胶分析仪拍照，采用Bio-1D++(法国Vilber Lourmat公司)软件分析结果，计算PepT1 mRNA的相对表达量。

1.5 数据处理及统计分析

采用Statistica 6.0统计软件One-way ANOVA程序进行单因素方差分析，Fisher’s LSD法多重比较，以 P＜0.05、P ＜0.01分别作为差异显著和极显著标准。

2 结果

2.1 鸡血清 h-EGF、T 3、PG 含量

由表1可知，连续5 d皮下注射EGF和PG对血清中h-EGF和PG含量无显著影响(P＞0.05);口服T4显著提高血清T3含量(P＜0.05)，口服甲巯咪唑则显著降低血清T3含量(P＜0.05)。

2.2 鸡小肠Pep T1 mRNA表达量

由图1和表2可知，不同激素处理对鸡小肠PepT1 mRNA表达量有显著影响(P＜0.05)。皮下注射PG(P ＜0.05)和口服T4(P ＜0.01)均显著提高了鸡小肠各肠段PepT1 mRNA表达量平均值，表明二者对鸡小肠PepT1 mRNA表达有上调作用，其中以T4的上调作用更为明显。皮下注射EGF和口服甲巯咪唑有降低PepT1 mRNA表达量的趋势，但均未达到显著水平(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 甲状腺素对鸡小肠Pep T1 mRNA表达的调控

甲状腺素的主要功能是维持动物正常生长发育、保持正常体温和能量代谢，其生理功能主要是通过与细胞核受体结合、加速mRNA形成并促进蛋白质合成。已知动物细胞内存在着一类DNA转录调节型受体系统，该类受体与甲状腺素和类固醇激素结合，激活mRNA的转录和转运蛋白的表达。Matosin-Matekalo等［26］报道，T3处理的Caco-2/TC7克隆细胞对葡萄糖的吸收提高了10倍，葡萄糖转运蛋白(SGLT1)mRNA表达量也随T3剂量的提高而提高，Na+，K+-ATP酶含量也有明显增加。另有研究同样发现，T3处理也以剂量依赖的方式提高葡萄糖转运蛋白(GLUT5)mRNA表达量［27］。关于甲状腺素对PepT1 mRNA表达影响机制的研究还未见报道。

表1 EGF、PG和T 4对鸡血清相应激素含量的影响Table 1 Effects of EGF，PG and T4 on contents of according hormones in serum of broilers

图1 鸡小肠Pep T1和β－肌动蛋白基因RT-PCR产物电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram of the RT-PCR products of PepT1 andβ-actin gene in small intestine of broilers

本次试验中连续5 d口服T4显著提高血清T3水平，并在转录水平上显著上调了PepT1 mRNA表达;而连续5 d口服甲状腺抑制剂则显著降低血清T3水平，PepT1 mRNA表达略低于对照组;表明T3水平与PepT1 mRNA表达之间存在一定的剂量依赖关系。这些结果表明，DNA转录调节型受体系统可能是调控肽转运系统信号过膜传导的途径之一。但据Ashida等［21］报道，T3处理在促进甲酰葡萄糖苷和苏氨酸吸收的同时，却抑制了Caco-2细胞对甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)的吸收，并降低了PepT1 mRNA表达量和PepT1蛋白含量，与本试验结果不一致，可能与哺乳动物和鸟类以及体组织和离体培养细胞之间的差异有关。

3.2 EGF对鸡小肠Pep T1 mRNA表达的调控

EGF是一类重要的生长因子，它是由50～60个氨基酸分子组成的多肽类活性物质。其主要功能是促进间质及上皮细胞增殖和分化，促进成纤维细胞和内皮细胞增殖，在体内介导上皮生长，促进血管形成，抑制胃酸分泌，加速伤口愈合等。近年来研究表明，EGF在肠道营养物质吸收方面也发挥着重要作用。

EGF具有调控肽转运系统的作用。Nielsen等［18］报道，EGF长期(26～28 d)培养 Caco-2 细胞使其Gly-Sar转运量降低约50%，转运最大速率降低90%，同时PepT1 mRNA表达量和细胞膜PepT1蛋白含量都明显降低，表明EGF是通过下调PepT1 mRNA表达降低细胞二肽转运能力的。另外，Nielsen等［15］发现 EGF 短期(5 min)刺激即能增加Caco-2细胞摄取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后达到平台期，转运最大速率提高了约50%，但并未影响PepT1 mRNA表达量和H+浓度，同时其促转运作用未受蛋白转运抑制剂(brefeldin A)的影响，表明 EGF处理不会影响PepT1蛋白的合成。

表2 EGF、PG和T 4对鸡小肠PepT1 mRNA表达量的影响Table 2 Effects of EGF，PG and T4 on the expression level of PepT1 mRNA in the small intestine of broilers

本试验未能观察到注射EGF对其在血清中含量和PepT1 mRNA表达量的显著作用，可能是本试验所用的h-EGF与鸡的表皮生长因子受体(EGFR)亲和力较差(人类和鸡的EGFR同源性为75%)，掩盖了EGF的作用，也有可能与药剂量较低有关。但PepT1 mRNA表达量有降低的趋势，与上述文献报道中长期效应的研究结果一致。

3.3 PG对鸡小肠Pep T1 mRNA表达的调控

PG是由胰岛细胞分泌的一种多肽激素。其主要功能是促进糖原分解和糖异生作用，使血糖升高。其作用是通过环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。此外，PG也能以肠细胞作为靶细胞，促进营养物质的吸收［28］。Thompson 等［29］在大鼠腹腔注射PG显著增加空肠细胞刷状缘膜电位，使葡萄糖和半乳糖的吸收提高50%以上，并可能增加缬氨酸的吸收。Debnam等［30］报道了PG可以直接作用于大鼠空肠上皮细胞，促进刷状缘膜微囊和基底膜微囊对半乳糖的吸收。而迄今关于PG与肽转运之间的联系仍未见研究报道。此外，现有报道中也未发现PG对营养吸收相关基因表达的影响。

本试验中，注射PG并未显著影响其在血清中含量，可能与PG极短的半衰期(5～10 min)有关。但每天1次的PG注射仍然影响了鸡小肠PepT1 mRNA表达量，在转录水平上上调了PepT1 mRNA表达量，显然PG具有促进鸡小肽吸收转运的潜力。但其是否确实存在该生理功能仍需进一步研究证实。

4 结论

①口服T4、甲巯咪唑分别显著提高、显著降低血清T3含量。

②皮下注射PG和口服T4均显著提高了鸡小肠PepT1 mRNA表达量，而皮下注射EGF和口服甲巯咪唑对其无显著影响。

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