金属硫蛋白与应激反应

杨利荣 张敏红

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、可以被金属等多种因素诱导的特异蛋白质，于1957年首次在马肾脏中发现并分离成功，后被证实普遍存在于多种真核生物体内。

MT约30%的氨基酸是半胱氨酸，含有大量的巯基基团，因而引起了科学研究者的关注。目前研究显示，MT作为机体的一种保护性蛋白质参与多种应激反应。国内外关于不同形式的刺激对MT的影响展开了大量的试验，包括低温刺激、皮肤创伤、电离辐射、重金属暴露和不同剂量锌饲喂等［1］。而有关MT在应激反应中的产生、调控及功能，国内外尚缺乏深入、系统、前沿的文献报道。故本文围绕MT与应激反应这一主题展开论述，重点介绍了MT在应激反应中的产生、调控及功能，旨在为MT在畜禽应激反应中的应用提供一定的理论依据。

1 M T在应激反应中的产生及相关调控

MT基因启动子部位含有多种调控元件，如金属反应元件(MREs)、抗氧化反应元件(ARE)、糖皮质激素反应元件(GREs)和转录激酶(STAT)反应元件等［2－3］。MT这种复杂的结构基础，决定了其容易被多种因素诱导的特性。

1.1 M T与重金属毒性应激

当啮齿类动物暴露于镉、汞等重金属离子时，肝脏MT合成增加［4－5］。重金属对MT转录水平的调节主要通过金属反应元件结合转录蛋白因子－1(MTF-1)与启动子部位的金属反应元件(MREs)相互作用实现的［6］。MTF-1在重金属诱导的MT产生过程中必不可少。MTF-1基因缺乏，则重金属无法诱导 MT基因的表达［7］。尽管MTF-1控制MT合成的确切机制还不清楚，但已有大量文献表明MTF-1蛋白上高度保守的6－锌指DNA结合区作为锌传感区发挥功能，并且这6个不同锌指之间的联结子能够积极参与调节MTF-1易位至细胞核内，并绑定在MT基因启动子部位［8］。

重金属可以增加MTF-1与MREs结合的能力，从而增加MT的转录［7］。MTF-1结合在MRE上需要锌的参与，尽管多种重金属可以诱导MTF-1对MRE的结合活性，但只有锌可以介导MTF-1结合到MREs上。因此，与MTF-1直接反应的只有锌，游离锌通过变构相互作用直接激活这种蛋白［9］。研究表明，重金属镉也能强烈诱导MT基因的转录，但并没有增加MTF-1与DNA的结合活性［10］。因此，有人推测镉并不依赖 MTF-1诱导MT的产生。同时认为，与锌相比，镉具有强氧化性，可能通过氧化应激途径。

1.2 M T与氧化应激

可诱导自由基产生的因子，如马来酸二乙酯、百草枯、促凝血药，都可导致啮齿类动物肝脏MT mRNA 的增加［11－13］。当小白鼠肝细胞暴露于活性氧产生器中，在不降低细胞活性的前提下，MT被诱导增加，并呈现剂量依赖性，这种增加基于MT基因的转录［14］。线粒体也是活性氧的一个主要来源。线粒体特异的活性氧发生剂，如抗霉素A、2，4 －二硝基苯酚也可诱导 MT 的合成［15］。

据报道，活性氧可能通过多种途径诱导MT的产生。例如，活性氧可与MT基因启动子部位ARE结合直接反应，也可间接通过增加细胞内贮锌蛋白，尤其是MT蛋白上锌的释放，增加的游离锌又可通过MTF-1调节MT基因的转录［16］。活性氧也可与不同的第二信使蛋白激酶通路相关联而介导 MT的发生［17］。然而，目前活性氧介导MT产生的确切调节机制尚不清楚。

1.3 M T与物理应激

急性固定、捆绑、寒冷等刺激时肝脏MT合成增加［18－19］。普遍认为糖皮质激素(GCs)在这种应激反应中发挥关键作用［20－21］。用糖皮质激素受体(GRs)阻断剂RU486处理的小鼠，MT合成明显不足［21］。

以上应激激活了下丘脑－垂体－肾上腺轴，并且提高了GCs的水平。GCs诱导MT不依赖其他调控序列。GRs正常存在于细胞质中，与热应激蛋白(HSPs)结合，这些HSPs可使GRs维持在无活性的结构。GCs进入细胞并与无活性的GR单体结合，诱导HSPs分离下来，并激活GRs。随后被激活的GR单体合并形成活跃的GR二聚体，二聚体以一种能量依赖的形式转移至细胞核内，绑定在MT基因调节区的GREs上，激活MT基因转录［22］。MT又可激活GR基因表达，二者相互作用［23］。

1.4 M T与炎性应激

炎症、细菌感染等反应可强烈诱导MT在肝脏的蓄积［24－25］，这一过程主要是由细胞因子介导的。巨噬细胞释放白细胞介素－1(IL-1)、白细胞介素－6(IL-6)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)，其中IL-6被认为是MT最有力的诱导物［26］。

IL-6与肝脏细胞膜上IL-6受体结合，致使受体聚集，这些受体簇激活联合的Janus激酶(JAK)，活化的JAK使信号转导蛋白和转录激酶(STAT)的活化剂磷酸化，活化剂形成二聚体，转移至细胞核内，通过绑定在MT基因调节区的STAT反应元件上诱导转录［27］。

1.5 M T与营养性应激

当机体处在禁食、饥饿、蛋白质－能量营养不良或锌、钙缺乏等营养性应激状态下时，肝脏MT的表达量可受到影响［18，28－30］。在营养性应激下，MT的产生机制很复杂，除了考虑上述GCs、细胞因子以及锌等因素的介导作用外，胰高血糖素和瘦素也成为关注的焦点，而试验结果表明，二者并不介导在营养性应激下 MT 的产生［18，30］。

1998 年 Beattie等［31］试验发现 MT-null小鼠在7周龄之前出现肥胖症，表现为体重、白脂肪组织重、肥胖基因表达以及血浆瘦素浓度等增加;22～39周龄时则更加肥胖，出现与肥胖动物模型，如糖尿病小鼠相似的症状。这些试验结果暗示MT与能量平衡存在某种关联。反过来，能量平衡也可能在一定程度上影响MT的合成。另外，营养性应激对生长激素轴的影响［32］早已被证实，这也为研究营养性应激下MT的变化机制提供了新的思维视角。

总之，由于MT基因启动子部位含有多种调控元件，而一种应激反应中也可能会涉及其他的应激反应，通常会表现出一种应激综合征，所以，MT在应激反应中的相关调控是非常复杂的。另外，染色质结构的改变可能有助于提高MT基因对各种诱导物的敏感性［33］，转录后调控对MT在各组织的表达量也有影响［34］。

2 M T在应激反应中的作用

研究表明，内源性诱导或外源性补充MT可增强机体对应激的耐受力。MT在应激反应中的作用主要表现在如下几个方面。

2.1 清除应激反应中产生的自由基

体内常见的抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)等。尽管MT与它们之间的关系尚不明确，但已有试验证明，MT清除自由基的能力强于GSH-Px和SOD［35］。MT蛋白约30%的氨基酸是半胱氨酸，含有大量的巯基基团，与GSH-Px相似，它们都是肝脏巯基的主要来源。重要的是，与GSH-Px和其他蛋白相比，MT中的巯基更易受到自由基的攻击［36］。MT中还原状态的巯基具有亲核性，其中的金属具有动力学不稳定性，这使得MT对自由基，如羟自由基(·OH)、超氧自由基(O－2·)或一氧化氮(NO)等具有较强的清除作用。目前已有大量体内和体外试验证实了MT抗氧化损伤的能力［37］。对于重金属引起的应激反应，MT除了可以清除自由基，还可直接螯合有毒金属汞、银、铅、镉、砷、铬、镍等，以解除重金属对机体的毒性。免疫组织化学研究已经证实，在快速增殖细胞的细胞质和细胞核内，均有MT表达的增加。MT在细胞核内贮留的意义还不清楚，但已经被认为可能是保护DNA免受氧化损伤或调节锌以供给与细胞分裂有关的关键酶和转录因子。

近年来，MT与细胞抗凋亡成为研究的一个热点。研究表明，MT可以保护细胞抵抗由氧化应激或重金属引起的细胞凋亡［38］。2003年，Shimoda等［39］用人类肿瘤细胞系 PLC/PRF/5、H460 和HepG2这3种细胞巧妙地证明，无论是MT基础表达量还是诱导表达量都与细胞抗凋亡能力有很强的相关性，MT含量越高，细胞抗凋亡能力越强。但目前MT抵抗细胞凋亡的细微调节机制尚不明确。

2.2 调节应激反应中锌的内环境稳态

体内具有锌依赖性的酶有300多种，同时，锌也是免疫系统的一种必需微量元素。锌的内环境稳态微妙地调节着免疫系统。锌缺乏会使原始T细胞和其他免疫细胞功能受损［40］。当机体处于应激状态下，正常状态下的锌内环境稳态被打乱，需要一种新的稳态形式来应对应激对机体的损伤。

而MT是目前公认的与锌内环境稳态有密切关系的蛋白，素有细胞内“锌池”之称［3，34］。MT 或MT mRNA已经被作为一个敏感指标来衡量体内锌的营养状况［41］。MT通过肠壁黏膜细胞有选择地决定锌的吸收。在应激状态下，MT增加机体从肠道及血液中锌的吸收与转移，通过调节锌在机体各个组织器官的重新分配来满足体内锌的平衡，从而及时保护机体重要器官［42］。

2.3 调节免疫反应

Borghesi等［43］试验结果显示，无论是把 MT单独添加到脾细胞培养中，还是与T细胞特异分裂素ConA或B细胞特异分裂素脂多糖(LPS)一起添加，MT都可以刺激鼠类淋巴细胞的增殖。这种增殖部分依赖于MT结合在淋巴细胞质膜上。在纯化了的T淋巴细胞和B淋巴细胞群中可以观察到MT在细胞质膜上的结合［43］。

MT还可以促进巨噬细胞的功能。Leibrandt等［44］证明向单核细胞系THP-1中添加LPS，可以导致MT合成减少。而MT产量的降低同时伴随着THP-1细胞承受LPS诱导的呼吸急促能力的抑制。这表明细胞内MT可能促进单核细胞的激活，而随着MT合成的减少，免疫反应在这方面的效力逐渐受到抑制。

MT对体内体液免疫也有影响。在MT存在的情况下，用卵清蛋白(OVA)或羊红血球(sRBC)免疫的小鼠对任意一种抗原其抗体水平都显著降低。例如，与仅注射OVA的小鼠相比，同时注射OVA和MT的小鼠的循环血中抗卵清蛋白免疫球蛋白G(IgG)降低了20% ～30%，尽管这2个处理的反应动力学相似。这表明MT对体液免疫起到了免疫抑制作用［45］。

MT介导免疫反应产生变化的分子机制有待进一步研究。以上对免疫反应的调节作用都基于MT蛋白主链上的巯基。如果MT被烷基化或将其巯基氧化，则刺激淋巴细胞增殖的效应就会消失［3］。

3 M T的非保护性功能

尽管MT参与多种应激反应，具有清除金属离子、自由基和其他生物学有毒物质的能力，但并非MT的所有功能都是积极的、保护性的。例如，镉－MT和锌－MT可以提高遗传毒性，造成单链DNA的损伤［46］。另外，MT还与金属介导的肾病有关联［47］。同时，MT的过度表达可以使卵巢癌化疗产生耐药性，并与致癌过程有关［48］。

4 小结

目前，MT与应激的相关研究以内源诱导及其机理性研究较多，很少涉及外源添加MT对应激反应的调节这一实践性问题。再者，研究对象多为啮齿类活体动物或其体外培养的细胞，在畜禽上的研究却很少。为了将MT有效地应用于畜牧生产中，积极进行MT与畜禽应激，如热应激、长途运输、仔猪断奶应激等相关研究显得很有必要。另外，MT与其他抗应激系统的关系尚不明确。如以往研究显示，体内常见的抗氧化系统(SOD、GSH-Px)及HSPs在应激反应中都发挥一定的作用，它们与MT是否发生于应激反应的不同阶段或发挥不同的功能?这些问题有待进一步研究。

［1］ 谭琼，张彬.金属硫蛋白与动物应激［J］.饲料工业，2007，28(7):23 －25.

［2］ COYLE P，PHILCOX JC，CAREY L C，etal.Metallothionein:the multipurpose protein［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2002，59:627 －647.

［3］ BORGHESIL A，LYNESM A.Stress proteins as agents of immunological change:some lessons from metallothionein［J］.Cell Stress ＆ Chaperones，1996，1(2):99－108.

［4］ TOMOKIK，NORIO I.Function of metallothionein in gene expression and signal transduction:new ly found protective role of metallothionein［J］.Journal of Health Science，2008，54(3):251－260.

［5］ JAMES C F，RODNEY R D，CHARLES C M，et al.Ron-induced metallothionein in chick liver:a rapid，route-dependent effect independent of zinc status［J］.The Journal of Nutrition，1990，120:1214 －1222.

［6］ PALM ITER R D.The elusive function ofmetallothioneins［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95(15):8428－8430.

［7］ HEUCHEL R，RADTKE F，GEORGIEV O，et al.The transcription factor MTF-1 is essential for basal and heavy metal-induced metallothionein gene expression［J］.The European Molecular Biology Organization Journal，1994，13(12):2870 －2875.

［8］ LI Y，KIMURA T，LAITY J H，et al.The zincsensing mechanism of mouse MTF-1 involves linker peptides between the zinc fingers［J］.Molecular and Cellular Biology，2006，26(15):5580－5587.

［9］ WESTIN G，SCHAFFNER W.A zinc-responsive factor interacts w ith a metal-regulated enhancer element(MBE)of the mouse metallothionein-Ⅰgene［J］.The European Molecular Biology Organization Journal，1988，7:3763 －3770.

［10］ STOHS S J，BAGCHID.Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions［J］.Free Radical＆ Medicine，1995，18(2):321－336.

［11］ BAUMAN JW，LIU J，LIU Y P，et al.Increase in metallothionein produced by chem icals that induce oxidative stress［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1991，110(2):347－354.

［12］ BAUMAN JW，LIU Y P，ANDREWSG K，et al.Exam ination of potential mechanism(s)of metallothionein induction by diethylmaleate［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1992，117:226－232.

［13］ M IN K S，TERANO Y，ONOSAKA S，et al.Induction of hepatic metallothionein by nonmetallic compounds associated w ith acute-phase response in inflammation［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1991，111:152－162.

［14］ ANDREWSG K.Regulation ofmetallothionein gene expression by oxidative stress and metal ions［J］.Biochem ical Pharmacology，2000，59(1):95－104.

［15］ KONDOH M，INOUE Y，ATAGIS，et al.Specific induction ofmetallothionein synthesis by m itochondrial oxidative stress［J］.Life Sciences，2001，69(18):2137－2146.

［16］ DALTON T P，LIQ，BITTEL D，et al.Oxidative stress activates metal-responsive transcription factor-1 binding activity.Occupancy in vivo ofmetal response elements in themetallothionein-Ⅰ gene promoter［J］.The Journal of Biological Chem istry，1996，271(42):26233－26241.

［17］ ARIZONO K，PETERSON K L，BRADY F O.Inhibitors of Ca2+channels，calmodulin and protein kinases prevent A23187 and other inductions ofmetallothionein mRNA in EC3 rat hepatoma cell［J］.Life Sciences，1993，53(12):1031－1037.

［18］ HIDALGO J，ARMARIO A，FLOS R，et al.The Influence of restraint stress in rats on metallothionein production and corticosterone and glucagon secretion［J］.Life Sciences，1986，39:611 －616.

［19］ OLSSON P E，HYLLNER S J.Differences in metallothionein gene expression in primary cultures of rainbow trout hepatocytes and the RTH-149 cell line［J］.Biochim ica et Biophysica Acta，1990，1049:78－82.

［20］ HIDALGO J，GIRALT M，GARVEY J S，et al.Physiological role of glucocorticoids on rat serum and liver metallothionein in basal and stress conditions［J］.The American Journal of Physiology，1988，254(1):71－78.

［21］ HERNANDEZ J， CARRASCO J， BELLOSO E，et al.Metallothionein induction by restraint stress:role of glucocorticoids and IL-6［J］.Cytokine，2000，12(6):791－796.

［22］ COLLINGWOOD T N，URNOV F D，WOLFFE A P.Nuclear receptors:coactivators，corepressors and chromatin remodeling in the control of transcription［J］.Journal of Molecular Endocrinology，1999，23:255－275.

［23］ GIRALT M，GASULL T，HERNANDEZ J，et al.Effect of stress，adrenalectomy and changes in glutathionemetabolism on rat kidney metallothionein content:comparison w ith livermetallothionein［J］.Bio-Metals，1993，6(3):171 －178.

［24］ ARIZONO K，KAGAWA S，HAMADA H，et al.Nitric oxidemediated metallothionein induction by lipopolysaccharide［J］.Research Communications In Molecular Pathology and Pharmacology，1995，90(1):49－58.

［25］ DE S K，MCMASTER M T，ANDREWSG K.Endotoxin induction of murine metallothionein gene expression［J］.The Journal of Biological Chem istry，1990，265(25):15267－15274.

［26］ SCHROEDER J J，COUSINSR J.Interleukin-6 regulatesmetallothionein gene expression and zincmetabolism in hepatocytemonolayer cultures［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1990，87(8):3137－3141.

［27］ BOUDNY V，KOVARIK J.JAK/STAT signaling pathways and cancer.Janus kinases/signal transducers and activators of transcription［J］.Neoplasma，2002，49(6):349－355.

［28］ PALIWAL V K，KAMBADUR R，PRASAD R，et al.Effect of protein calorie malnutrition and calcium deficiency on hepatic iso-metallothioneins in Cd-exposed monkeys［J］. Biochem istry International，1985，11(3):397－405.

［29］ HIROM IW，AKIO H，MOMOKO C，et al.Effects of dietary zinc deficiency onmetallothionein，zinc and copper concentrations in liver and bonedensity of trained m ice［J］.Biomedical Research on Trace Elements，1999，10(3):167 －168.

［30］ KONDOH M，TSUKAHARA R，KURONAGA M，et al.Enhancement of MT synthesis by leptin in fasted m ice［J］.Life Sciences，2002，71(20):2425 －2433.

［31］ BEATTIE J H，WOOD A M，NEWMAN A M，et al.Obesity and hyperleptinem ia in metallothionein(-Ⅰ and-Ⅱ)nullm ice［J］.Proceedings of the National Academ y of Sciences of the United States of A-merica，1998，95:358－363.

［32］ STRAUSD S.Nutritional regulation of hormones and grow th factors that control mammalian grow th［J］.Federation of American Societies for Experimental Biology Journal，1994，8(1):6 －12.

［33］ BIRD A P.Functions for DNA methylation in vertebrates［J］.Cold Spring Harbor Sym posia on Quantitative Biology，1993，58:281－285.

［34］ HAQ A F，MAHONEY M，KOROPATNICK J.Signaling events formetallothionein induction［J］.Mutation Research，2003，533:211－226.

［35］ THONALLEY P，VASAK M.Possible role formetallothioneins in protection against radiation-induced oxidative stress kinetics and mechanisms of reaction w ith superoxide and hydroxyl radicals［J］.Biochim ica et Biophysica Acta，1985，827:36－44.

［36］ M IURA T，MURAOKA S，OGISO T.Antioxidant activity ofmetallothionein compared w ith reduced glutathione［J］.Life Sciences，1997，60(21):301 －309.

［37］ SATO M，BREMNER I.Oxygen free radicals and metallothionein［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，1993，14(3):325－337.

［38］ LU H，HUNT D M，GANTIR，et al.Metallothionein protects retinal pigmentepithelial cells againstapoptosis and oxidative stress［J］.Experimental Eye Research，2002，74:83－92.

［39］ SHIMODA R，ACHANZAR W E，QU W，et al.Metallothionein is a potential negative regulator of apoptosis［J］.Toxicological Sciences，2003，73:294 －300.

［40］ RINK L，HAASE H.Zinc homeostasis and immunity［J］.Trends in Immunology，2006，28(1):1－4.

［41］ 吴立专，李丽立，张彬，等.金属硫蛋白在动物营养学上的应用［J］.长江大学学报，2006，3(1):156－159.

［42］ MCCORM ICK C C.Induction and accumulation of metallothionein in liver and pancreas of chicks given oral zinc:a tissue comparison［J］.The Journal of Nutrition，1984，114(1):191－203.

［43］ BORGHESIL A，YOUN J，OLSON E A，et al.Interactions of metallothionein w ith murine lymphocytes:plasma membrane binding and proliferation［J］.Toxicology，1996，108:129－140.

［44］ LEIBRANDT M，KOROPATNICK J.Activation of human monocytes w ith lipopolysaccharide induces metallothionein expression and is dim inished by zinc［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1994，124(1):72－81.

［45］ LYNES M A，BORGHESI L A，YOUN J，et al.Immunomodulatory activities of extracellular metallothioneinⅠ:metallothionein effects on antibody production［J］.Toxicology，1993，85:165 －177.

［46］ MULLER T，SCHUKELT R，JAENICKE L.Cadm ium/zinc-metallothionein induces DNA strand breaks in vitro［J］.Archives of Toxicology，1991，65(1):20－26.

［47］ WANGX P，CHAN H M，GOYER R A，et al.Nephrotoxicity of repeated injections of cadm ium-metallothionein in rats［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1993，119(1):11－16.

［48］ THIRUMOORTHY N，MANISENTHIL KUMAR K T，SHYAM SUNDAR A，et al.Metallothionein:an overview［J］.W orld Journal of Gastroenterology，2007，13(7):993－996.