功能性多糖与家禽肠道黏膜免疫调控的构效关系

杨小军 王筱霏 尹瑞卿 姚军虎

(西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100)

胃肠道作为家禽一个重要组织器官既是食物消化吸收的主要场所，又是大多数病原侵入机体的主要门户。集约化家禽养殖过程中面临诸多的应激因素，在采食过程中家禽肠道接触大量的致病性抗原，肠道黏膜免疫系统生理功能很难在短时期内发育完善，故常出现肠道炎症性疾病;同时，随着广谱、高效抗生素的大量使用，肠道黏膜菌群平衡遭到破坏，使得肠道黏膜表面条件性致病菌感染显得较为突出，如大肠杆菌肠炎。另外，自2006年欧盟全面叫停饲料用抗生素后，鸡肉中抗生素残留等问题也极大地阻碍了我国鸡肉产品的出口。特异、高效细菌抗性物质的研发将极大推动我国肉鸡养殖的高效、健康发展，提高我国畜禽产品的国际竞争力。

多糖是一类广泛存在于动物、植物和微生物细胞中具有特殊活性的重要生物大分子物质。随着分子生物学研究的进展，人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而复杂的生物活性，已经引起医药界高度重视，并成为当今生命科学研究的热点之一。功能性多糖具有免疫调节作用、抗肿瘤作用、抗病毒作用、抗衰老作用、抗动脉粥样硬化作用、对物质代谢具有影响、抗溃疡作用、类肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素作用以及对辐射损伤的保护等作用。多糖的构效关系是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性之间的关系，化学结构是其生物活性的基础，是当今糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题。

我国对多糖的研究起步比较晚，始于20世纪70年代，但近年来发展迅速，研究对象涉及真菌类、地衣类、植物、花粉和动物等。研究的范围包括多糖的分离纯化、结构分析、理化性质、免疫学、药理学以及治疗应用等，对其免疫增强作用机制的研究已深入到分子和受体水平。研究的方法涉及化学、生物学和医药学等诸多领域。我国动物营养学家近些年试图从不同角度来研究控制肠道细菌性疾病，也研制出一些产品，如多糖、酸化剂和益生素等。但在多糖的应用上存在很大的盲目性，在未明晰具有抗性的功效物质及其作用机制的情况下，随意地选择中药多糖进行添加，极大地制约了多糖类抗菌物质的应用。本文旨在在综述多糖的研究现状的基础上探讨多糖结构与其免疫调节作用的构效关系，以期为多糖饲料添加剂的合理应用和研究提供科学依据。

1 多糖研究现状

目前，以多糖结构、功能和药用研究为核心的糖工程被认为是继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中最具挑战性的一个科学前沿，迄今已有数百种植物、微生物多糖被分离提取，研究的对象涉及真菌类、地衣类、植物以及花粉、微生物等多种来源的多糖［1－2］。多糖的结构复杂，由不同的单糖残基在不同的连接位置以不同类型的糖苷键连接，形成具有不同构象、不同相对分子质量的多糖。多糖的结构决定其功能，而多糖的分离纯化是结构分析的基础，因此国内外的学者在多糖的分离、纯化、结构分析、结构修饰以及活性测定方面做了大量的研究工作，发现它们具有抗氧化、抗疲劳、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、降血脂和调节机体免疫能力等多方面的药理作用，尤其是对免疫功能的调节［1－8］。但是因为功能性多糖类化合物在天然产物中含量低，而且分离提取困难，部分多糖的质量标准不易控制，限制了多糖的研究，使其远远落后于蛋白质和核酸的研究。目前多糖的研究仍侧重于分离纯化、化学组成及生物活性等方面，对多糖的空间结构及其在体内的作用机制等都未及深入。中国的多糖资源十分丰富，具有十分巨大的开发潜力，而且随着科学技术的发展，分离纯化技术的不断进步，传统方法与现代科学仪器的结合使用，多糖越来越多的性质被人们所认识，也逐步地应用于临床各种疾病的治疗当中，如用于慢性乙型迁延性肝炎及消化道肿瘤的放、化疗辅助药物香菇多糖注射液(批准文号:国药准字 H20030131;药品本位码:86904840000308;生产单位:金陵药业股份有限公司福州梅峰制药厂)，用于预防和治疗慢性支气管炎、感冒及哮喘的卡介菌多糖核酸注射液(批准文号:国药准字 S20020019;药品本位码:86904944000013;生产单位:湖南斯奇生物制药有限公司)和用于治疗慢性肝炎、肿瘤病的猪苓多糖注射液(批准文号:国药准字Z11020812;药品本位码:86900243000075;生产单位:中国中医科学院实验药厂)等(国家食品药品监督管理局)。因此，多糖的结构及功能研究正在逐步地进行中，有着广阔的前景和研究空间。

2 多糖的免疫调控作用

大肠杆菌感染造成肉鸡生长发育迟缓、生产性能下降、饲料报酬下降、死淘率及屠宰废弃率增加以及药费增加等，给养殖业造成了极大的经济损失。大肠杆菌关键性致病因子脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又称内毒素，位于革兰氏阴性细菌的外膜中，可激活单核巨噬细胞、内皮细胞合成并释放多种细胞因子，导致全身性炎症反应。在畜禽养殖中常导致一系列病理反应，包括脓毒症、脓毒性休克和多器官功能障碍综合征等。LPS进入循环系统后，刺激免疫细胞产生大量具有致热效应的炎性细胞因子，如NF-κB，引发细菌感染。LPS还会启动补体系统及活化T细胞，引起个体免疫系统的过度活化。随着“LPS受体激活簇”理论的提出，开展LPS结构性识别与跨膜信号转导引起细胞炎症反应构效关系的研究将对预防畜禽养殖应激和炎症反应有很好的推动作用。

早有研究证实，K1荚膜多糖是侵入性大肠杆菌的一种很重要的致病因素［9］。最新研究报道，革兰氏阴性菌LPS可诱发动物肠道、肺、心、肾和肝的炎症反应［10－12］。有研究发现，动植物致病菌的胞外多糖可以通过鳌合钙抑制非特异性免疫应答［13］。Chang 等［14］研究发现，鲍氏针层孔菌多糖(PBP)可以显著增强LPS和伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的小鼠 B、T淋巴细胞增殖，且PBP在12.5～100.0μg/m L呈剂量依赖型抑制淋巴细胞一氧化氮(NO)的产生，结果提示PBP可以刺激免疫活性并抑制炎症反应。以上表明，一些功能性多糖可能具有增强动物体对致病性细菌抗性的作用。Guo等［15］研究发现，中草药多糖可以增强感染柔嫩艾美尔球虫肉鸡的免疫反应，减轻因感染球虫所致的体增重下降，表明多糖对于增强球虫抗性效果起到了很好的保护作用。研究发现，黄芪多糖可以显著增加肉鸡ND抗体滴度和淋巴细胞增殖，改变 CD3+、CD4+和 CD8+T细胞比例，增强正常免疫程序下肉鸡的免疫效果［16］。Xu等［17］研究发现，LPS可经TLR4/PI3K途径诱发免疫细胞分泌炎症信号分子(高迁移率基团box-1)。Kim等［18］发现松菇多糖可以促进受LPS刺激的巨噬细胞分泌 NO，并提高 IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α基因的表达，其机制可能涉及松菇多糖的TMF-Ⅱ可以使IκB磷酸化从而活化NF-κB。酵母细胞壁多糖占细胞壁干重的90%，主要有α－D－甘露聚糖和β－D－葡聚糖，二者与免疫系统有明显的互作特性，多糖的合理应用可以调控黏膜免疫从而维护动物健康、抵抗疾病。酵母细胞壁多糖可以减少致病菌鞭毛在肠道黏膜上皮细胞的黏附，降低致病菌毒素的危害，加快致病菌的排出［19］。由此可见，多糖可以作为一种天然生长促进剂应用在家禽生产中。

3 多糖构效关系研究

多糖的结构是决定其生物活性的最主要因素，而构效关系的研究将为多糖的目的性筛选和分子修饰提供理论指导。分子修饰是通过化学、物理和生物学方法对高分子化合物进行结构改造，以获得功能、活性更强衍生物的方法，是通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基的种类、数目和位置来发挥作用的。但多糖构效关系研究还未及深入，只能确定高级结构比一级结构在活性方面起更大的作用。

对于水溶性β－D－1，3－葡聚糖，只有分子量大于90 ku才能形成3股螺旋的高度有序结构，具有3股螺旋结构的葡聚糖大多都有多糖的免疫活性［20］。LPS可经TLR4途径诱发肠道上皮细胞炎症反应，而幽门弯曲菌LPS经TLR2/MEK 1/2-ERK1/2信号通路促进 IL-8分泌，诱发肠道疾病［21］，表明不同细菌胞外LPS与宿主细胞的互作通路也是不一样的，即多糖结构决定其生物学功能。

利用核磁共振技术(NMR)对来自肠聚集性大肠杆菌522/C1菌株和大肠杆菌O/178菌株的抗原多糖结构的比较发现，这2种抗原多糖具有完全相同的重复结构单元［22］。A li等［23］在随后的研究中发现，来自肠聚集性大肠杆菌87/D2菌株和大肠杆菌O128菌株的抗原多糖含有的乙酰基具有相似的作用。通过分析来自大肠杆菌87的抗原多糖发现，水解产物包括海藻糖、葡萄糖、半乳糖、2－氨基－2－脱氧葡萄糖、2－氨基－2－脱氧半乳糖和庚糖，它们之间比率为 22∶12∶22∶4∶35∶4。Kiyohara等［24］研究认为，黄芪多糖 β －D －1，3－半乳糖体或β－D－1，6－半乳糖基的降解将显著降低其对肠道派伊尔氏斑淋巴细胞的免疫调节活性。提示β－D－1，3－半乳糖或β－D－1，6－半乳糖基在黄芪多糖免疫调节活性上有重要作用。在对太白茶多糖的4个组分分析中发现，由于其糖组成、分子量和连接方式不同而表现出了不同的免疫活性［25］。Telepnev 等［26］研究分析，LPS 酰基化后，能抑制树突细胞TLRs受体介导的涉及炎症反应的信号通路。这一试验验证了多糖结构的改变将影响到其生物学功能。硫酸化多糖在免疫调节上反映出双面性——抑制或促进。硫酸化多糖可以抑制炎性细胞因子介导的细胞信号转导，表现在抑制补体活化、抑制淋巴细胞黏附或穿越内皮细胞。相反，细菌分泌的硫酸化多糖可以激活免疫细胞，促进抗原识别和捕获。其作用与其结构紧密相关，如分子量、硫酸化位点的不同，尤其是硫酸化二糖程度、硫酸化位置和硫酸化结构域，也许其是决定多糖免疫作用不同的主要原因［27］。多数革兰氏阴性(G－)细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和沙雷氏菌等都含LPS，其中O－特异的、富含甘露糖的多糖(甘露聚糖)具有一些免疫特性。LPS具有同质甘露糖聚合物，其在激活补体系统活性上要高于异质多糖，可以激活补体系统诱导非特异性免疫，但由于许多细菌有复杂的细胞外膜结构，所以能够对补体系统产生良好的抗性［28］。由上述可知，多糖的结构与其生物学功能有着密不可分的关系，对多糖结构进行适当的修饰可以增强其生物学功能。

4 小结

不同结构的多糖其免疫调节活性功能不一，现仍普遍缺乏具体核心寡糖片段与肠道上皮细胞或肠道淋巴细胞分子靶标的点对应的构效关系研究。针对现有研究现状和本课题组工作基础，笔者认为分析功能性多糖的定植位点和结构，比对分析不同多糖与LPS的分子结构和作用的分子靶标，构建多糖与分子靶标的构效关系及其下游信号通路，将为具有家禽肠道免疫功能调控作用的多糖的目的性筛选、定向分子修饰及抗生素替代品的开发研究提供理论支持。

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