HPLC法同时测定复方苦参肠炎康片中苦参碱和氧化苦参碱的含量

刘 莹，孟庆妍，翟宏宇

(吉林省食品药品检验所，吉林 长春 130033)

复方苦参肠炎康片是由苦参、黄连等8味中药材及提取物组成的复方制剂,具有清热燥湿止泻的作用。用于湿热泄泻。近年来采用高效液相色谱法文献较少，且多为采用C18色谱柱测定其中苦参碱单一成分[1-2]或采用氨基色谱柱同时测定苦参碱和氧化苦参碱，极少见采用C18色谱柱同时测定苦参碱和氧化苦参碱的报道。本文参考文献方法[3]的流动相，选择并优化色谱条件，建立一种采用反相高效液相色谱法使用C18色谱柱同时测定该复方制剂中苦参碱和氧化苦参碱的含量的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪(包括四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Agilent色谱工作站)，AE-160型电子分析天平(METTLER TOLEDO)(十万分之一)，AG-135型电子分析天平(METTLER TOLEDO)(百万分之一)，KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。 对照品苦参碱(批号110805-200306)和氧化苦参碱(批号110780-200506)(均为含量测定用)购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，磷酸为色谱纯。其他试剂为分析纯。水为超纯水。 复方苦参肠炎康片(规格：片芯重0.4 g，通化东宝药业股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取苦参碱对照品21.95 mg、氧化苦参碱对照品12.0 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取混合对照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加入氯仿10 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液制备 取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL、浓氨试液2 mL，密塞，称定重量，轻轻摇匀，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，转移至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性样品溶液的制备 取缺苦参的阴性样品，同“2.2”项下方法操作，制得阴性样品溶液。

2.4 色谱条件 色谱柱：Gemini-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液(将磷酸二氢钾3.402 g溶解于1 000 mL水中，用磷酸调结至pH 3.0)(7∶93)；流速：0.8 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL。在上述色谱条件下，苦参碱与氧化苦参碱的保留时间分别为10.330 min和20.438 min，二者的分离度为20.4。

2.5 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标,峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，苦参碱和氧化苦参碱的回归方程分别为Y=794.09X+7.38r=1.000 0Y=765.23X+0.36r=1.000 0。结果表明：苦参碱进样量在0.175 6～3.512 μg，氧化苦参碱进样量在0.103 84～2.076 8 μg范围内,与峰面积具有良好的线性关系。

2.6 精密度试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积。结果苦参碱和氧化苦参碱峰面积的RSD(n=6)分别为0.64%，0.05%。表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在 0、2、8、18、30 h测定，苦参碱和氧化苦参碱峰面积的 RSD (n= 5)分别为0.43%和0.59% 。说明供试品溶液在 28 h内稳定。

2.8 重复性试验 精密称取同一批号的复方苦参肠炎康片(批号070302)2 g，共6分，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定。结果苦参碱和氧化苦参碱含量平均值(n=6)分别为4.0 mg/g，4.9 mg/g，RSD分别为2.33%和1.76%，表明该方法重复性良好。

2.9 回收率试验 精密称取已测知含量的复方苦参肠炎康片(批号070302)粉末分，每分1 g，每分精密加入含苦参碱0.183 52 mg/mL和氧化苦参碱0.195 66 mg/mL的混合对照品的三氯甲烷溶液50 mL，按“2.2”项下的方法制备所需溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，计算回收率。结果苦参碱和氧化苦参碱的平均回收率(n=6)分别为96.64%和99.88%，RSD分别为1.3%和2.7%。

2.10 样品测定 分别取不同批次的复方苦参肠炎康片，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液5 μL，在上述色谱条件下进行分析，测定峰面积，用外标法计算出苦参碱和氧化苦参碱的含量，结果3批样品中苦参碱的含量分别为8.0，4.0，6.2 mg/片；氧化苦参碱的含量分别为2.0，4.8，2.3 mg/片。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 分别对苦参碱和氧化苦参碱进行光谱扫描，根据扫描结果，并参考2005年版中国药典中苦参含量测定项下的检测波长[1]，故选择220 nm为测定波长。

3.2 供试品制备方法的选择 分别采用样品用浓氨试液-氯仿超声、浓氨试液-甲醇超声、盐酸-甲醇超声。结果表明使用盐酸-甲醇超声杂质过多，无法进行分析；浓氨试液-甲醇超声提取含量最高，但是杂质较多，无法达到基线分离；浓氨试液-氯仿超声，提取含量较高，杂质少，样品分离度好，故选用浓氨试液-氯仿为提取溶剂。

样品由浓氨试液-氯仿超声提取后的滤液无法直接注入高效液相色谱仪进行分析，故需要进一步处理。分别采用将一定量滤液蒸干后用甲醇溶解，加磷酸盐缓冲液稀释、取一定量的滤液直接用甲醇稀释。结果表明滤液蒸干后用溶剂定容的样品苦参碱和氧化苦参碱的含量均有所下降，表明上述2种生物碱不稳定，蒸干对含量有影响。故采用将滤液直接用甲醇稀释的方法制备供试品溶液。

3.3 3批样品的测定 经过对3批样品的测定，试验结果表明各批样品苦参碱和氧化苦参碱含量差别较大，但是二者和差别并不大，所以用二者的和控制复方苦参肠炎康片的质量更加合理。

3.4 色谱柱的考察 中国药典2005版一部中药材“苦参”【含量测定】项下采用氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱同时测定苦参碱和氧化苦参碱[1]，氨基键合硅胶柱较少应用，推广起来受一定限制，并且试验结果表明使用氨基键合硅胶柱出峰较快，难于分离成分复杂样品。故本文建立了一种全新的采用普通C18柱同时测定处方中苦参碱和氧化苦参碱的方法。

3.5 分离条件的选择 采用C18色谱柱比较不同的流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至8.0)、乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 6.8)-三乙胺、甲醇-磷酸盐缓冲液(pH 3.0)。结果表明以甲醇-磷酸盐缓冲液(pH 3.0)平衡时间短，分离效果佳，该流动相可使苦参碱和氧化苦参碱均能达到基线分离。

3.6 进样量的选择 由于供试品溶液的极性和流动相的极性相差较大，进样量过大会导致峰型不佳，出现峰变宽甚至分裂，进样量过小有可能导致进样不准确，所以进样量定为5 μL较合适。

[1]蒋珍藕.苦参碱的提取工艺及测定方法的研究进展[J].中医药导报,2005,11(8):90.

[2]叶秀金,宋粉云.HPLC法测定清肺抑火丸中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].中国药房,2011(12):1127-1129.

[3]罗德启攵.高效液相色谱法测定痒灌洗剂中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].医药导报,2011(1):103-104.

[4]楼文斌,徐艳艳.治伤软膏中苦参碱的含量测定[J].齐鲁药事,2009(9):531-533.