应用细胞病毒抑制法测定干扰素生物学活性

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(1.长春中医药大学药学院,吉林 长春 130012；2.长春金赛药业有限责任公司，吉林 长春 130012)

《细胞病毒抑制法》是进行干扰素生物学活性测定的方法，现已收录在《中国药典》3部附录[1]，此法是进行干扰素生物学活性测定的依据和标准，但是此方法实施环节多，影响因素多，这就要求实验者在进行此实验时了解影响实验的各项因素，避免在各环节出现错误，从而得出准确的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器 恒温磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂)；百级超净台；酶标仪(anthos 2010)。

1.2 试剂及药品 人羊膜细胞(中国药品生物制品检定所生化室)；MEM培养基(Gibicol)；重组人干扰素α2b活性标准品(中国药品生物制品检定所)；VSV病毒(中国药品生物制品检定所生化室)；胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所 TBD0012HYX)；乙醇(北京化工厂20061115)。

1.3 培养基的灭菌方式及存放时间[2-3]

1.3.1 培养基的灭菌方式 培养基为MEM培养基分为3种：完全培养基(含10%胎牛血清)，测定培养基(含7%胎牛血清)，攻毒培养基(含3%胎牛血清)。同时在培养基中加入双抗(青霉素和链霉素)。

1.3.2 培养基的存放条件及时间 液体培养基要存放在冷藏箱中,通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月～1年。

1.4 冻存细胞的复苏及复苏浓度 将取出的冻存细胞迅速至于40 ℃温水中,使冻存管中的物质在1 min内融化，加于10 mL完全培养基中。在进行实验时发现，冻存细胞的数量过少，不利于细胞的复苏，细胞生长缓慢，状态欠佳。所以在冻存细胞时细胞的数量要适中，以利于复苏后细胞的生长。同时，在实验过程中，要及时进行状态最佳细胞的再冻存工作，这样有利于细胞的再应用。

1.5 消化时间及细胞状态观察 按照《中国药典》[1]规定进行配制。在使用前，消化液应置于室温平衡后使用。消化的时间范围约为15～30 min，同时应根据细胞的状态结束消化时间。

1.6 铺板 按照《中国药典》[1]要求进行铺板，在铺板时应使用准确性高的枪头，如进口枪头，避免液体挂壁带来的影响；排枪在细胞培养中是常用的仪器，使用排枪时应倾斜45°，液体吸取完毕时，将枪头在盛装液体的器皿空白处划出，将挂在枪头外壁的多余液体留在器皿空白处。在向孔中排出液体完毕时，将枪头从孔中划出，将枪头内的剩余液体留在孔内，以确保在铺板时，每孔体积的准确性。

1.7 加样 向孔内添加需要测定的样品时，应注意加入样品的体积的准确性，操作方法如1.6。

1.8 病毒攻击

1.8.1 病毒保存地点 病毒攻击是此法中重要的环节，此法中使用的病毒为VSV病毒(水泡性口炎病毒)，需保存在-70 ℃冰箱中保存。

1.8.2 加病毒时间 将病毒从-70 ℃冰箱中取出,应在10 min之内，将病毒加至细胞培养板中，病毒在室温条件下，毒力会随着时间的推移降低，为准确反映病毒毒力，所以这个步骤要迅速。

1.9 细胞病变点的观察 经过反复实验，可知，细胞病变点的观察应结合2个原则:1)标准品A行细胞基本无死亡且H行细胞基本全部死亡；2)标准品D行或E行半数细胞死亡点。

1.10 细胞培养板脱色 《中国药典》[1]中规定，使用流水进行染色细胞培养板的脱色，但是由于流水速度难以控制，力量不均匀，不利于操作，所以经过反复实验，采用的方法为：用盆接水，将细胞培养板放入盆内冲洗，换水3次，冲洗3次，即可洗去浮色，脱色完成。

2 结果

2.1 培养基的灭菌方式及存放时间 应用0.2 μm滤器进行培养基的灭菌处理，防止高温灭菌对培养基成分的破坏。

在实际操作中，为防止培养基存放时间过长对细胞生长不利，培养基的配制量应不超过2周为宜。培养基在使用前需37 ℃预热或在室温平衡后再使用。

2.2 细胞状态决定消化时间及效果 倒置显微镜下观察培养的贴壁细胞贴在细胞培养瓶表面生长，形态正常，状态为致密单层。

将细胞培养瓶从二氧化碳恒温培养箱中拿出后，放置于室温，加入一定量消化液，消化一段时间后，显微镜下观察细胞基本皱缩变圆。

消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的消化液流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。所以在应消化至可轻吹或随培养基轻摇下最好。

2.3 细胞病变点观察

2.3.1 加入VSV病毒进行攻击，细胞培养板中，正常的攻击状态是：干扰素生物学活性标准品A行细胞基本无死亡且H行细胞基本全部死亡。

2.3.2 加入VSV病毒进行攻击，细胞培养板中，正常的攻击状态是：标准品D行或E行出现细胞半数死亡点。

3 结论

《细胞病毒抑制法》为干扰素生物学活性检测方法，是各研究所和医药企业进行干扰素生物学活性检定的标准，但是目前，由于各检定场所环境和人员操作的不同，导致应用此方法对干扰素生物学活性检测的结果重复性差。要求操作人员对此方法的熟练程度高，且应掌握各环节对实验结果的影响，本实验对各环节的影响因素进行了重复实验，试图通过实验消除各环节的影响，从而利于操作人员对实验的把握[4-5]。

[1]中华人民共和国家药典委员会.中国药典(三部)[M].北京：化学工业出版社,2005:附录56.

[2]黄志荣.MTT比色法在干扰素生物学活性测定中应用的探讨[J].海峡药学,2006,18(6):23-26.

[3]刘铁成,于淼,曹翎婕.重组人α-2b型干扰素生物学活性测定方法的改进[J].黑龙江医药,2000,13(4):15-18.

[4]韩蕾,黎耕.重组人干细胞生长因子(rhSCF)生物活性测定方法研究[J].中国药学杂志,2004,39(2):56-59.

[5]贾茜,周兴军.重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性测定方法研究[J].中国生化药物杂志,2001,22(1):89-91.