nNOS参与药物成瘾时中枢神经系统的功能变化

李华 王丽 秦星

成瘾研究关键在于了解滥用药物如何改变大脑并引起具有成瘾特征的异常行为的复杂途径。该领域的关键挑战之一是认定在大脑中，药物诱导的相对稳定的改变以解释那些持续存在的行为异常。例如，对药物成瘾的人在戒除药物若干年后，仍可能存在高风险的复吸。这些异常行为的稳定性提示，它们可能至少部分通过基因表达的改变。慢性吗啡引起神经元的可塑性和适应性改变的基础被认为是转录因子调节一些基因表达蛋白增加，使机体稳态重建的结果。转录因子CREB经磷酸化激活调控靶基因表达上调在其中起重要作用［1］。神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)基因受CREB调控［2，3］，该基因被认为参与吗啡依赖和耐受的形成［4］。CREB通过与nNOS基因外显子2启动子内的CRE序列作用调控nNOS基因表达［2，5］，且外显子2是nNOS基因翻译的起始部位［5］。本文就nNOS基因在中枢神经系统的分布及功能作一综述。

1 nNOS的活性调节

nNOS为Ca2+/钙调蛋白依赖型(calcium/calmodulin-dependent isoforms)，合成及释放NO量较少(pM)。胞浆内游离Ca2+(free cytosolic Ca2+)是nNOS活性最重要的调节者，它通过与钙调蛋白相互作用而激活nNOS。动作电位激活位于神经膜上的电压依赖Ca2+通道，并激活细胞内钙库释放Ca2+。钙调蛋白与nNOS结合并激活nNOS需胞浆内游离Ca2+浓度升至400 nM以上。当Ca2+浓度降低时，Ca2+与钙调蛋白分离，从而导致钙调蛋白与nNOS分离。这样Ca2+/钙调蛋白象开关一样控制nNOS的活性。尽管对磷酸化知之甚少，但其构成调节nNOS活性的另一机制。cAMP依赖蛋白激酶(cyclic AMP-dependent protein kinase)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)或Ca2+/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，Ca2+/CaMKⅡ)导致的磷酸化降低nNOS的催化活性［6］。

在中枢神经系统(central neuronal system，CNS)，调节NO的合成主要依赖Ca2+通过受体依赖的离子通道内流(influx)，尤其通过兴奋性神经递质如谷氨酸激活突触后NMDA受体［7］。nNOS氨基末端具有一个PDZ结构域，其有大约100个氨基酸组成，并与许多蛋白质作用，把它们锚定到细胞骨架元件(cytoskeletal element)，如synaptic densitie和相应的膜相关鸟氨酸激酶(membrane-associated guanylate kinase)。在nNOS存在的情况下，PDZ结构域与突触后密度蛋白(postsynaptic density protein)PSD-95相互作用，而NMDA受体由于包含一个 Ser/Thr-X-Val基序(motif)，故也可与PSD-95结合。作为支架蛋白(scaffolding protein)，PSD-95可使NMDA受体接近nNOS，并直接使nNOS暴露在通过激活NMDA受体而产生的进入离子通道的Ca2+流中。其它受体激活所引起的短暂的Ca2+流，由于浓度太低，当这些受体接近nNOS时，不能产生相似的作用。NO的生物活性可能反馈控制离子通道，如关键的半胱氨酸S－亚硝酰化作用(S-nitrosylation)，可下调NMDA受体。有很多潜在的NMDA受体/nNOS偶联及其下游信号转导通路的调节者。nNOS配体PDZ的羧基末端蛋白(protein carboxy-terminal PDZ ligand of nNOS，CAPON)被认为与nNOS活性相关，并与nNOS分布区域相似。CAPON通过与与PDZ结构域的结合，使nNOS与质膜分离。因此，CAPON决定与质膜结合的nNOS的数目，以此调节CNS中神经元内NO的合成。此外，CAPON可将nNOS锚定到其它的大分子(macromolecule)上，如the small G-protein Dexras-1，这一过程的意义尚不知晓［6］。

nNOS也可通过与nNOS蛋白抑制剂(protein inhibitor of nNOS，PIN)相互作用而被抑制。PIN为一种高度保守的小分子蛋白质，最初被认为能破坏nNOS二聚体的稳定性而作为内源性nNOS抑制剂。可是，最近报道提示PIN是nNOS的轴突运输蛋白，而不是它的调节者。nNOS可能通过与caveolin-1和caveolin-3相互作用，把钙调蛋白从nNOS上置换下来而被抑制。此外，caveolin家族成员可与其它的信号分子，如c-src，Ha-ras和GS相互作用，这些提示nNOS在其它的信号转导通路中具有潜在作用。另外，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)可调节血红素(haem)与nNOS的相互作用［6］。

在氮能神经元，存在突触前自动调节(presynaptic automodulation)，这一调节作用可能是NO与血红素类型的NOS共同作用的结果。研究表明，细胞维持低水平的cGMP以产生NO，其原因在于细胞内Ca2+水平增加，激活nNOS的同时，也激活Ca2+/钙调蛋白依赖的 cGMP磷酸二酯酶(Ca2+/calmodulindependent cyclic GMP phosphodiesterase)，以降解 cGMP［6］。

2 NO的合成及其介导的信号转导过程

内源性NO是由一组一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)末端胍基中的一个氮原子氧化而合成，并使L-Arg转变为 L-瓜氨酸(L-citrulline)。NOS家族包括三个成员，即I型(type I)为nNOS，II型(type II)为诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)，III型(type III)为内皮型 NOS(endothelial NOS，eNOS)。这些异构体(isoform)尽管结构相关，但它们的遗传起源、解剖分布、离子依赖的活性和病理生理作用各不相同。nNOS和eNOS为固有型，在许多细胞和组织中均有表达，为Ca2+/钙调蛋白依赖性;iNOS为非Ca2+依赖型，存在于所有的细胞类型中，巨噬细胞和血管平滑肌细胞内含量最多，在炎症、疾病及组织损伤时其生成增加［7］。

NOS包含两个不同的结构域，氨基末端结构域(NH2-terminal domain)包含L-Arg结合位点，而羧基末端还原酶结构域(COOH-terminal reductase domain)能把电子转移到氨基末端结构域，并含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的结合位点，该位点序列高度保守［6，7］。

氮能神经这一名称的采用反应了该神经的递质功能依赖于NO的释放或其传递过程由NO所引起，这些过程强调了NO特殊性质。NO的物理特性使其不能储存在脂质层的囊泡内，也不能被降解酶水解。因此，与经典递质不同，NO及不储存于囊泡，也不以胞裂外排方式释放，仅仅依靠从神经末梢扩散［6］。

NO的信号转导，主要通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble of guanylyl cyclase，sGC)偶联的受体，导致cGMP在胞浆堆积，从而启动信号转导的级联反应［8］。其可能性的受体有五种，即四种异源二聚体(alpha1beta1，alpha2beta1，alpha1beta2，alpha2beta2)和一种同源二聚体(nubeta2)。NO的作用是通过其与众多蛋白质的半胱氨酸的巯基、S-nitrosylation及金属中心发生作用而影响蛋白质功能。sGC一直被认为是nNOS发挥生理作用的主要靶点，并有充分的证据表明cGMP水平升高介导NO众多的生理功能。免疫组织化学技术证明sGC和cGMP的分布与nNOS互补。在功能上，氮能神经(nitrergic nerve)受刺激或应用NO供体(NO-donor)可增加细胞内cGMP浓度。而这些反应可被cGMP类似物模拟，而抑制cGMP降解可加强氮能神经受刺激的结果。在CNS和外周的平滑肌，NO众多的作用与cGMP升高之间的机制目前尚不清楚，但其最终结果是细胞内游离 Ca2+浓度(intracellular free Ca2+concentration，［Ca2+］i)降低。cGMP另外的靶点可能涉及开放Ca2+和Na+内流的离子通道，cGMP依赖蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)的激活，与环二磷酸腺苷核糖(cyclic adenosin diphosphate ribose)相关的作用及通过调节cGMP依赖磷酸二酯酶(cyclic GMP-dependent phosphodiesterase)而与 cAMP 相互作用［6］。

在血管和神经系统，PKG是NO和cGMP主要的效应器。分子水平的研究证实，两个遗传位点编码哺乳动物的PKG。编码PKGⅠ的基因已被从牛肺的血管平滑基细胞的可溶性提取物中分离出来并测序。其cDNA的分子克隆证实，氨基末端不同的剪接方式产生PKGI和PKGI异构体。近来来自大脑和肠粘膜上皮的膜相关PKGⅡ已被克隆。在中枢神经系统，PKG酶活性在小脑选择性升高，而组织化学显示高水平的PKGI蛋白存在于浦肯野神经元［8］。

在线粒体，NO调节氧的消耗。纳摩尔浓度的NO抑制线粒体呼吸链中的细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)及末端含血红素的酶。最近证据证明这种效应是可逆的，氧可在此过程中同NO竞争，这些提示NO是产生能量和通过线粒体介导细胞死亡的关键调节者。NO的这一作用参与细胞或组织的损伤过程。另外，与糖酵解能力不同有关，NO的这一作用可解释为什么神经元和胶质细胞对NO诱导的损伤显示不同的敏感性［6］。

NO与其他的神经递质的释放和它们产生的效应有关，尤其是乙酰胆碱(acetylcholine)、去甲肾上腺素(noradrenaline)、多巴胺(dopamine)、谷氨酸(glutamate)、-氨基丁酸(-aminobutyric acid)、血清素(serotonin)、三磷酸腺苷(adenosin triphosphate)、蛙皮素(bombesin)、一氧化碳(carbon monoxide)、阿片(opioid)及内皮素(endothelin)。这些相互作用的机制目前未完全了解，但受体直接的S－亚硝酰化作用、cGMP依赖蛋白磷酸化的级联反应、神经元能量动力学和转运体功能的调节均明显参与这些过程。另外，激活2-肾上腺素能受体(2-adrenoceptor)、烟碱受体(nicotinic receptor)及purinergic receptor等可通过突触前调节 NO 释放［6］。

3 nNOS在中枢神经系统的分布

大脑内nNOS含量最多。尽管脑血管和神经胶质细胞也含有nNOS，但以神经元内为主。大脑的很多区域都含nNOS神经元，以小脑和副嗅球密度最高。

尽管nNOS神经元约仅占大脑皮层神经元的1%，实际上，皮层的每个神经元均暴露在nNOS神经末梢范围内。从形态学的观点来看，nNOS神经元在CNS的分布具有明显的异质性(heterogeneity)，即组成一个由不同的中间神经元组成的群体。另外，nNOS神经元的数目和化学特征依其所在的脑区不同而异，而同时该酶不与任何单一的神经递质共存。nNOS或者位于突触前或者突触后，因而其与神经元的信号转导(neural signalling)、神经毒性(neurotoxicity)、突触可塑性(synaptic plasticity)及与行为有关的神经通路的调节(如学习及痛觉)密切相关［6］。

所有的nNOS阳性神经元都显示-NADPH-黄递酶活性，其已成为氮能神经元(nitrergic neurone)的标志。可是早期的研究结果证实，这一结论可能受不正确的固定程序限制，应小心对待［6］。

在CNS种，nNOS与兴奋性氨基酸NMDA受体分布一致，这两个系统存在密切联系。NO首次被作为CNS中细胞间的信使是因为其介导谷氨酸受体激活而引起cGMP水平升高［6］。

4 NO在CNS的作用

4.1 NO参与突触可塑性 NO作为逆行信使(retrograde messenger)协调两种突触可塑性强度，即长时程增强(long-term potentiation，LTP)和长时程减低(long-term depression，LTD)。LTP是很多中枢兴奋型突触(excitatory synapse)的特性，其特征是突触传递(synaptic transmission)持续增强或突触强度(synaptic strength)增加，可持续数小时、数周，甚至更长。诱发LTP的过程未完全了解，但涉及谷氨酸与amino-3-hydroxy-5-methylisooxazole-4-propionic acid(AMPA)或N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体的作用。这导致一系列事件的激活，如Ca2+/CaMKII、NOS及蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase)。LTP被认为是学习和记忆的突触联系(synaptic correlate)，最明确的是，在较高级的大脑中枢，LTP参与认知功能，尤其是在大脑皮质(cerebral cortex)和海马(hippocampus)。nNOS和神经元内存在的eNOS均参与LTP的形成，缺少这两种酶的动物则表现出LTP降低。NO诱导LTP形成的主要效应器是GC，但ADP核糖化作用(ADP-ribosylation)和钙调蛋白激酶的激活均参与此过程［6］。

NO参与海马LTP的早期阶段。突触后NO可通过激活GC，产生cGMP，然后激活PKG，PKG也是海马LTP产生的重要分子，而 PKG抑制剂可抑制 LTP的产生。这样，通过 NO-cGMP-PKG信号通路提高突触传递，产生活性依赖性长时程递质释放增加，诱导LTP产生［6］。

LTD是具有平行纤维突触传递强度的持续减低，其在浦肯野细胞的爬行纤维受到重复兴奋刺激后发生。突触传递强度减弱源自突触后AMPA受体敏感性降低，该受体介导蛋白激酶C(protein kinases C，PKC)、PKG和NO-cGMP信号转导通路的激活。LTD在小脑中研究的最多，并把小脑中的LTD作为运动记忆的模型。但在大脑的较高级区域，也可观察到LTD［6］。

4.2 NO参与CNS的功能 NO通过调节突触的可塑性，对大脑发育、记忆和行为的形成具有复杂的影响。抑制NO合成，产生健忘症(amnesia)、破坏空间学习(spatial learning)和嗅觉记忆(olfactory memory)，导致在被要求完成任务时行为迟缓及完成习惯任务的运动能力降低。NO参与视觉过程(visual processing)、辨别学习(discriminative learning)、吃喝行为(food and drinking behaviour)、温度调节(thermoregulation)、阿片依赖和耐受(opiate tolerance and dependence)、昼夜节律(circadian rhythm)、睡眠和呼吸类型的产生过程。同样地，由催产素能和5-羟色胺能通路(oxytocinergic and serotoninergic pathways)介导的行为反应(behavioural response)被认为涉及NO的产生或中枢氮能神经元受到刺激［6］。

4.3 nNOS与吗啡 NO在中枢神经系统发挥许多重要作用，包括调节吗啡的作用。NO可拮抗吗啡的止痛作用，在吗啡依赖和耐受形成中起重要作用［9-12］。应用非选择性NOS拮抗剂N-硝基-L-精氨酸(N-nitro-L-arginine，NO2Arg)通过调节内源性强啡肽系统，使大脑多个脑区的内源性强啡肽A水平升高，可缓解吗啡身体依赖［11］和耐受［13］，并对吗啡精神依赖具有部分逆转作用［12］。L-精氨酸能易化吗啡依赖、耐受及精神依赖形成。这些研究提示NO参与了吗啡依赖、耐受及精神依赖的形成。

nNOS作为中枢神经系统内含量最多的NOS，被认为是与药物依赖关系密切的NOS。在吗啡依赖和耐受大鼠中枢神经系统及受吗啡长时程作用的SK-N-SH细胞株，均发现nNOS基因表达上调［14］。nNOS反义寡核苷酸可明显缓解大鼠吗啡戒断和耐受，选择性nNOS抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)逆转吗啡诱导的条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)［15，16］。

NO作为中枢神经系统内信息分子的发现急剧地改变了神经元通讯的概念，NO在中枢神经系统的多重作用引起广泛关注。nNOS表达增高参与了吗啡依赖和耐受的形成，调节nNOS表达水平可能是缓解阿片类依赖和耐受的一种可能途径。

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