参麦注射液对裸鼠皮下移植瘤抗血管生成作用的机理探讨

马亚军，钱晓萍，周荣平，张有成

(1南京市江宁医院，南京211100;2南京大学医学院附属鼓楼医院)

参麦注射液(SM)由人参、麦冬提取物混合组成，具有益气养阴的功效。研究表明［1］，SM在体外和荷瘤小鼠体内有明显的抗肿瘤血管生成作用。2005～2006年，我们制作了裸鼠荷人LOVO细胞大肠癌模型，旨在探讨SM对裸鼠人大肠癌移植瘤血管生长的抑制作用及机理。

1 材料与方法

1.1 材料及动物 SM为正大青春宝药业公司产品。人大肠癌LOVO细胞由南京市鼓楼医院细胞实验室培养。4～6周BALB/c-nu小鼠(SPF级)10只，均为雌性，重量16～18 g，购自上海斯莱克公司。血管内皮生长因子(VEGF)小鼠抗人一抗、CD34小鼠抗人一抗购自Neo Markers公司，凝血酶敏感蛋白1(TSP1)小鼠抗人一抗、抗小鼠二抗工作液购自Novocastra公司。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠肿瘤模型制作 在37℃、5%CO2孵箱环境下，将人大肠癌LOVO细胞接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，当肿瘤细胞处于对数生长期时，用生理盐水将其制成浓度1×107个/ml的细胞悬液，取0.2 ml接种于裸鼠腋窝皮下。成功建立裸鼠肿瘤模型后，将小鼠随机分为两组各5只，对照组腹腔注射生理盐水0.4 ml/d，SM组腹腔注射SM 20 ml/(kg·d)，均连续2周。

1.2.2 VEGF、TSP1检测 2周时，采用脱颈椎法处死两组小鼠，完整剥取肿瘤。用10%甲醛固定24 h，对肿瘤组织进行脱水、透明、石蜡包埋，5 μm连续切片，行常规HE染色。采用免疫组化染色法检测微肿瘤血管密度(MVD)、VEGF及TSP1。PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.3 评定标准 ①肿瘤质量抑制率:从给药第1天起，每2 d测量肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积。停药后处死小鼠，剥取瘤块，称取肿瘤质量，计算肿瘤质量抑制率。②MVD:采用Weidner判断标准。VEGF、TSP1在血管内皮细胞膜及胞质中均呈棕黄色。先用低倍镜判断整个切片的染色强度，然后在高倍镜下选择3个微血管密集区;染色强度和阳性细胞率相加为每个区域得分，两者之和0分为阴性，1～4分为弱阳性，＞4分为强阳性。染色强度记分:0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳;阳性细胞率记分:阳性细胞 ＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS11.0统计软件，计量资料用±s表示，组间比较用t检验、χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘤体生长情况 用药第1、7、13天，对照组肿瘤体积分别为(898.5 ±252.0)、(1 521.5 ±560.5)、(3 496.4 ±976.2)mm3，SM 组分别为(583.8 ±124.5)、(868.5 ±181.1)、(1 698.2 ±532.0)mm3，两组肿瘤体积比较P＜0.05。用药后，对照组肿瘤负荷较重，表现为形体消瘦、皮色差、行动迟缓;SM组肿瘤负荷较轻，表现为皮毛光亮、行动正常。

2.2 肿瘤质量抑制率 对照组肿瘤质量为(2.90±0.65)g，SM 组为(1.48 ±0.66)g，两组比较 P ＜0.01。SM组肿瘤质量抑制率为49%。

2.3 两组 MVD比较 对照组 MVD为(48.7±18.8)%，SM 组为(20.0 ±4.4)%，两组比较 P ＜0.01。

2.4 两组 VEGF比较 对照组 VEGF为(5.2±0.3)分，VEGF 表达强阳性;SM 组分别为(3.8 ±0.3)分、VEGF表达弱阳性。两组比较P均＜0.01。

2.5 两组 TSP1比较 对照组、SM组 TSP1均为(0.2±0.3)分，其TSP1定性均为阴性;两组比较 P均 ＞0.05。

3 讨论

肿瘤血管生成与实体肿瘤的生长、转移密切相关，抑制实体肿瘤血管生成，阻断肿瘤营养供应，是肿瘤抗血管生成治疗的主要理论基础。目前认为，肿瘤血管生成过程中存在内皮细胞活化、增殖、迁移和基底膜降解等环节，肿瘤血管生成促进因子和抑制因子调控着肿瘤血管生成的进程;当血管生成促进因子升高或其抑制因子降低时，可促进肿瘤生长与转移;反之则抑制肿瘤的生长和转移。

MVD是反映恶性肿瘤生物学行为的重要指标，多数恶性实体肿瘤的发生、发展、转移及患者的预后与肿瘤MVD密切相关。Tse等［2］研究发现，在乳腺癌组织或有恶变趋势组织中MVD升高，正常组织或良性肿瘤组织中MVD降低。本研究显示，SM 20 ml/kg可明显抑制人大肠癌LOVO细胞移植瘤生长，明显降低小鼠肿瘤组织的MVD，抑制其血管生成，说明抗血管生成是SM抗肿瘤的重要机理之一。

VEGF是一种具有肝素活性的生长因子、高效的内皮细胞有丝分裂素，能特异地作用于血管内皮细胞，直接促进内皮细胞增生，增加内皮细胞通透性，对血管生成有极强的诱导作用［3］。许多实验证实，肿瘤组织 VEGF强表达与 MVD呈正相关［4］。TSP1是分子量为450 kD的同源三聚体基质糖蛋白，由多种细胞合成，并分泌到细胞外基质中发挥生理作用。1990年，Good等［5］首先发现TSP1有抗血管生成活性。Yee等研究发现，进展性肿瘤早期TSP1可发挥抑瘤效应。本研究显示，SM 20 ml/kg可明显下调肿瘤组织的VEGF表达，对TSP1无调节作用;说明SM的抗血管生成机理可能与其直接作用于血管内皮细胞、抑制血管生成，下调VEGF表达、间接干扰肿瘤血管生成有关。

总之，本研究证明，SM可抑制小鼠的肿瘤血管生成，发挥抗肿瘤作用，为SM的抗肿瘤治疗开辟了新思路。

［1］尹丽慧，高承贤，丁志山，等.参麦注射液对血管生成影响的研究［J］.中国中西医结合杂志，2002，10(22):761-763.

［2］Tse GM，Ma TK，Chan KF，et al.Increased microvessel density in malignant and borderline mammary phyllodes tumors［J］.Histopathology，2001，38(6):567-570.

［3］Longo R，Gasparin G.Challenges for patient selection with VEGF inhibitors［J］.Cancer Chem Pharm，2007，60(2):151-170.

［4］Seo Y，Baba H，Fukuda T，et al.High expression of vascular endothelial growth factor is associated with liver metastasis and a poor prognosis with ductal pancreatic adenocarcinoma［J］.Cancer，2000，88(10):2239-2245.

［5］Good DJ，Polverini PJ，Rastinejad F，et al.A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(17):6624-6628.