VB12检测技术研究进展*

崔明，杨大进，鲁杰，王竹天

(中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京，100021)

VB12检测技术研究进展*

崔明，杨大进，鲁杰，王竹天

(中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京，100021)

VB12是一种水溶性维生素，在食品中含量极低，特别是由于动物食品组分更为复杂等因素，使其检测异常困难。文中从样品水解提取技术、固相萃取净化技术、VB12的转化技术、检测技术等方面对国内外文献中VB12的分析方法进行综述。

食品;富集净化;维生素B12;检测技术;综述

VB12［1］又称钴胺素(cobalamins)，是一组由钴结合咕啉环的红色类咕啉化合物的总称。其作为维持人体正常代谢和机能不可缺少的一种微量营养素［2］，主要生理功能已基本明确［3］。VB12对人体健康的影响主要为缺乏所致，现已成为继叶酸之后全球微营养素和疾病预防领域中关注的又一新的热点。VB12多存在于富含高蛋白、高脂肪的动物食品中，以结合态和游离态2种形式存在，其中以结合态存在的VB12又分为两类，一类是结合咕啉蛋白，另一类是中间丝状蛋白 IF(intermediate filament)［4－5］。VB12的检测至今是国际上食品分析的难题之一，首先是动物食品中的VB12有多种结构形式，如羟钴胺素、腺苷钴胺素、甲基钴胺素、氰基钴胺素等，传统的分析方法很难反映其实际含量;其次VB12在食品中的含量低，迄今检测最高含量的牛肝为60μg/100g，通常食品含量在0.4 ～3μg/100g;再者，VB12主要以 VB12-内因子复合物的形式存在，充分提取和分离难度很大;另外，样品中其他色谱行为与VB12相近的水溶性维生素也会对它的分离检测造成很大干扰。本文从样品检测技术、水解提取技术、固相萃取净化技术、VB12的转化技术、等方面对国内外文献中VB12的分析方法的研究进展情况进行了概括总结，为动物性食品中VB12的分析研究提供必要参考。

1 VB12检测方法

VB12经典的分析方法为微生物法随着现代仪器灵敏度和选择性的提高，使得建立快速、操作简便的化学测定法成为可能。

1.1 微生物测定法

微生物测定法［7］是依靠莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)等菌种在一定的条件下，生长与繁殖和VB12的含量成线性关系的原理，通过测定浊度或光密度来确定细菌生长和繁殖的强度，从而间接地测定食物样品中VB12的含量，是一种半定量方法。目前GB 5413.14－2010(婴幼儿食品和乳品中VB12的测定)和AOAC法均采用此法。Fumio Watanabe等［8］用微生物测定法对猪肝等食品中VB12进行检测，检测限为 0.01 μg/L。Esteve 等［9］用该法对生鲜猪肉中VB12进行测定，测得鲜猪肉中VB12含量在0.41～1.11 μg/100 g。该法虽然具有灵敏度较高的特点［8，10－13］，但是由于试验耗时长，操作复杂，重现性差等缺点，有被化学法替代的趋势。

1.2 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

酶联免疫吸附法(ELISA)［14］作为含量测定的一种粗筛方法，可用于食品中VB12的检测。Reichert等人［15］用竞争性蛋白质结合分析法(CPBA)使氰钴胺素共轭结合在聚苯乙烯ELISA测试板上，让R蛋白与氰钴胺素结合，检测限达135～262 pg/kg，回收率82.1% ～103.3%。Sharma 等［16］使用 ELISA 对乳品中的VB12进行了测定，对牛乳，羊乳的中的检测限可达3.91μg/kg。ELISA方法虽然具有后期分离时保持物质原始活性的特点，但由于成本较高、适用范围狭窄、存在假阳性等缺点，使其应用受到一定的限制。

1.3 薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)

有学者采用薄层色谱法(TLC)［17］对富含VB12的样品进行测定，其原理是利用VB12与杂质组分在薄层上展开速度的差异而进行分离、净化、测定。Tanioka等［18］使用silica gel 60 TLC 配合E.coli 215大肠杆菌生物自显影法对食品中的VB12进行了测定。方法的检测限为0.10 g/100 g，定量限为0.30 g/100 g。从Tanioka等人的研究不难看出，TLC法检测限过高，不适合动物性食品中低含量的VB12测定。

1.4 原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrophotometry，AAS)

原子吸收分光光度法［19］是利用钴原子的特征吸收与经过消化处理的VB12中的钴原子含量成正比关系，从而达到间接测定样品中的 VB12含量的目的。Sagaya等［6］使用火焰原子吸收分光光度计，将VB12胶囊，VB12注射液在尿素、过氧化氢的碱性环境下进行消解，得到游离的钴元素，从而间接计算出VB12的含量，方法的检测限5 pg/mL，线性范围10pg/mL～1μg/mL，回归系数0.999 8，回收率在97% ～99.2%。该方法虽然有较高的灵敏度，但是由于无法去除样品基质中其他钴元素本底的引入，使测定结果往往高于样品中VB12的含量值。

1.5 化学发光法(chemiluminescence，CL)

化学发光法［8］是近年来发展起来的另一种测定VB12的高灵敏分析方法。Fumio Watanabe 等人［8］使用化学发光法对海藻保健食品中的VB12进行了测定:经过前处理后VB12直接进入全自动化学发光检测器进行监测，检测限在0.05 μg/L、变异系数1.2% ～6.7%。化学发光法由于其特异性可以用于鉴别海藻保健品中的 VB12和 VB12的类似物［20］，但由于需购置特定的仪器设备——化学发光仪，使得方法的普及和推广受到限制。

1.6 高效液相色谱-紫外法 (high performance Liquid chromatography-UV，HPLC-UV)

高效液相色谱法-紫外法(HPLC-UV)［21］随着仪器普及率的不断提高以及检测技术推广的需要，越来越成为VB12分析工作者重点研究的方向。Jonh Dalabacke等［22］在研究中发现，VB12在水溶液中的3个吸收波长分别是278、361、550 nm。Mussie等［23］使用反相C18柱(150 mm ×4.6 mm，5μm)和紫外检测器对海水中VB12进行测定，方法的检测限在0.042 ng/L，回收率92% ～99%。Marley等［10］对功能性饮料、啤酒、小麦类早餐制品、碳酸饮料中的VB12进行了测定，检测结果相对标准偏差在0.8% ～10%之间，检测限0.44 μg/100g。Campos-Gimenez 等［13］使用免疫亲和柱配合HPLC对牛乳大豆婴儿配方食品中的VB12进行了测定，检测限和定量限分别为0.10、0.30μg/100 g，回收率为93.3% ～108.3%。高效液相色谱-紫外法相对于微生物法具有快速、分离完全、重现性好等特点，渐渐成为广大VB12分析工作者重点研究的方向。

1.7 高效液相色谱-荧光光度法(high-performance liquid chromatography-fluorescence spectrophotometry，HPLC-FS)

高效液相色谱-荧光光度法［24］主要是使用特定的衍生试剂将本身不具有荧光的VB12进行衍生处理，得到的衍生产物具有荧光而达到间接测定的一种分析方法。Li等［25］使用275 nm作为激发波长，305 nm作为发射波长，对婴儿配方乳制品的VB12进行了检测，研究发现用荧光光度法测定VB12时，pH=7.0是最佳酸碱度，该方法检出限为0.1μg/L。Pakin等［11］把猪肝中得到的 VB12转化成α-Ribazole形式，使用250 nm作为激发波长，312 nm作为发射波长对其进行检测，方法的定量限在3 ng/g。Fumio Watanabe等［26］使用DMEQ(喹喔啉酮)对牛肉、猪肉、牛奶中的VB12进行衍生，使用365 nm作为发射波长，447 nm作为激发波长，配合荧光分光光度计，测得牛乳的VB12检测限在0.2～10μg/L。荧光光度法与紫外可见分光光度法相比，前者对VB12拥有更好的选择性和灵敏度，并且具有使用试样少，线性范围宽等特点，但是荧光光度法易受溶剂极性、内部所含重金属原子和温度的影响造成荧光淬灭等现象。

1.8 质谱法(mass Spectrometry，MS)

质谱法(MS)［27］是是利用离子化技术，将各种构型的VB12分别电离成相应的离子，然后依据质荷比的差异而达到构型分离的一种高灵敏的分析方法。Luo等［12］曾经用 HPLC-ESI-MS方法对 VB12进行测量，回收率在 93% 以上。Koyyalamudi等［28］也使用了HPLC-ESI-MS方法测定白顶蘑菇中 VB12的含量。Chen等［29］也用了CE-ICP-MS联用技术对海藻制品的VB12进行分析，氰钴胺素，羟钴胺素的检测限分别是0.3 ng/mL 和 0.2 μg/mL。Baker 等［30］使用 CEICP-MS法对多种钴胺素标准溶液进行了测定，在电泳电压30 kV下，检测限50 ng/mL，Hubert Chassaigne等［31］在研究中使用了电喷雾离子源(IS-MS)和ICP-MS联用技术，取得了10 ng/mL的检测灵敏度。与HPLC-UV法相比，质谱法拥有着更高的灵敏度和更低的检测限。但由于HPLC-MS仪器价格昂贵、运行费用较高，很少在VB12的测定中广泛使用。

2 样品前处理方法

样品前处理指样品的制备及对待测组分进行提取、净化、浓缩，以及将被测组分转变成可测定的形式后进行定量、定性分析的实验过程。样品前处理的目的是消除基体干扰，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。前处理手段不当会出现组分损失、干扰组分不能完全除去或引入杂质等问题。因此，样品前处理是分析检测过程的关键环节，只要检测仪器稳定可靠，检测结果的重复性和准确性就主要取决于样品前处理。VB12的前处理包括净化、富集、对VB12进行衍生等技术。

2.1 VB12提取

目前针对动物性食品中VB12的提取多采用酶水解、酸水解、微波消解、透析等方法。

2.1.1 酶水解提取法

酶水解是利用酶的生物催化作用水解样品的一种方法。通过酶解手段释放与蛋白结合的VB12，从而为获得游离VB12与结合型VB12的总量提供基础。目前国际上主要使用胃蛋白酶对动物样品进行水解以实现对VB12的测定。Pakin等人［11］用胃蛋白酶水解结合反相液相色谱对VB12进行测定，在pH=4的醋酸缓冲溶液中对猪肝、鸡蛋、牛肉，鲜鲑鱼、鲜鲭鱼等样品进行酶解，使得结合态VB12与蛋白质得以分离。该方法有良好的回收率(95% ～100%)和较好的重现性(相对标准偏差为 1.0% ～5.4%)。Luo等人［12］在分析乳制品中VB12时加入淀粉酶和胃蛋白酶，方法的回收率达到了93%，检测限为2 ng/g。Bjørn Liaset等人［32］使用复合蛋白酶对鲑鱼样品进行水解，VB12在鳕鱼中的含量为0.11 mg/kg，在三文鱼中的含量为0.11 mg/kg。表明酶水解法适合于处理高蛋白和高脂肪基质的动物样品，方法处理条件温和，是目前分析动物制品中VB12使用最常见的提取方法。

2.1.2 酸水解提取法

酸水解法是利用酸的消化作用对样品基质进行分解，使 VB12离解的一种方法。Anna Lebiedzinskat等［4］将三文鱼、牡蛎、猪肝等样品在 121℃ 时用0.055 mol/L的盐酸对其进行水解，处理时间4h，方法的回收率为96.5%，且测定VB12的同时可测定其他B族维生素。该方法相对于酶水解而言，具有诸如加热温度高，加热时间长等不利之处。

2.1.3 微波消解法

微波消解法是利用极性分子在高频交变电场中高速震荡引起振动产生的热能，从而使样品快速、有效的释放出VB12的一种提取方式。微波消解法与酸水解方法相比具有高速、简便的特性，由于不加入其他化学助剂，微波消解法同时也具有空白值低的特点。Chen等［8］将样品冻干粉碎后，采用微波消解法对其中VB12进行提取，微波功率设置为600 W，压力689 kPa时，最终回收率在95% ～106%。但也有相关文献报道，在没有CN－的衍生保护时，使用微波加热法对样品进行处理会导致部分VB12的 降解:Fumio Watanabe等［5］使用600 W 2 450 MHz的微波下对猪肉，牛乳，牛肉进行了加热，时间6 min，在没有CN－的衍生化保护时微波对样品中羟基钴胺素的损失将达到30% ～40%。Fumio Watanabe等［33］在中性环境下使用500 W、2 450 MHz的微波单独对羟钴铵素标准溶液加热，时间为6 min，结果发现羟基钴胺素产生了降解，损失率达45%。故针对VB12微波消解法尚是一种值得商榷的前处理方法。

2.2 维生素VB12的富集净化

由于动物性食品中基质复杂，在提取过程中会同时提取出很多干扰组分，这些干扰组分会在后期的仪器分析中对目标化合物的准确定性、定量造成极大的影响。针对VB12的分析瓶颈也主要集中在该步骤，采用何种富集净化技术达到对痕量VB12的富集以及如何去除大量干扰杂质是研究的方向。

2.2.1 树脂吸附法

树脂吸附法是依靠树脂对样液中VB12的选择性吸附而进行富集净化的一种方法。Mussie等［23］对海水中VB12含量进行分析时将C18树脂装填于聚丙烯管中作为样品的富集净化手段，并配合HPLC-UV进行监测。方法的检测限为0.042 ng/L，线性范围为0.1～6μg/mL，回收率为92% ～99%。王重等［34］使用了酚醛型吸附树脂对VB12溶液进行吸附，发现该树脂对VB12吸附量可达到84μg/g。树脂吸附法虽然具有很多优点，但对分离试样中杂质的含量要求较为严格，如提取液中杂质含量过高，可能导致吸附法效率下降等问题，使其应用受到一定的限制。

2.2.2 透析法

透析法是一种利用渗透和对流作用使VB12从半透膜的一侧移动到膜的另一侧，从而达到与样品提取液中杂质分离。透析法利用透析的特性，可以阻挡酶和蛋白质等大分子物质透过。Gustavo Medina-Alonso等［35］分别对脱脂奶、全脂奶、无乳糖奶、奶粉、炼乳等样品中的VB12含量进行测定，并配合使用高效液相色谱法，检测限可达到0.01 mg/L，相对标准偏差为0.45%。这种提取方法虽然具有常温提取、无热损失的优点，但是由于存在耗时长，提取不完全、适用范围窄等缺陷而很少被使用和推广。

2.2.3 固相萃取柱法

固相萃取法是20世纪90年代中期发展起来的一种样品富集净化手段，主要基于液-固相色谱法原理，采用不同填料床材料，对样品进行快速的富集、净化、分离［1］。Fang等［36］使用纤维管固相萃取技术对运动型饮料中的VB12进行了富集，方法的相对标准偏差为 3.5% ～4.3%，回收率为 92.4% ～99.2%。Jonh Dalbacke等［37］在分析复合维生素片所含VB12时使用了固相萃取技术，回收率达91% ～95%。Iwase Hiroshi等人［38］通过膜分离法配合固相萃取法对富含油脂的食品中的VB12进行了分析，结果线性范围0.1～3 ng/g，回收率高于90%，固相萃取法具有操作简、高效、可靠、消耗试剂小等优点。自出现以来迅速发展。作为一种前处理方法，固相萃取法在许多领域上取代了传统萃取方式。

2.2.4 免疫亲和法

免疫亲和法是一种利用抗原抗体特异性结合特性的固相萃取技术，根据抗原抗体的高选择性，从复杂的待测样品中提取目标化合物，是一种新型分离富集以及净化待测VB12的方法。样品经过酶解和氰钴铵素构型转化后，提取液可直接使用免疫亲和柱进行富集。Pakin等［11］使用免疫亲和柱进行样品的富集，洗脱液经氮吹浓缩，转化后样品定量限可到3 ng/g，样品的回收率为98%。Heudi等［39］使用免疫亲和柱对奶粉中VB12进行测定，定量限为2.5 ng/g，回收率为94% ～100%。Marley等［10］的研究中使用了 EASI-EXTRA免疫亲和柱对功能性饮料等样品进行提取分析，配合HPLC-UV检测，取得了较好的重现性，检测限0.44μg/100g，变异系数在 0.8% ～10%之间。免疫亲和法由于其自身特性，适合对高杂质、低含量样品中的VB12进行分析。但是免疫亲合法具有价格不菲，处理样品量少、免疫亲和柱保存条件苛刻的缺点。

2.3 VB12构型转化法

针对样品提取液中的VB12含微小的问题，在仪器分析过程中可以将其荧光衍生或者使其转化成另一种物质，由此提高该物质对于检测系统的响应，通常采用荧光衍生化和使其他形式的钴胺素转化成氰钴胺素的方法进行处理，使其达到分析的灵敏度。

2.3.1 α-ribazole衍生化法

α-ribazole衍生能够使VB12具有荧光性质，其优点是能使方法的特异性增强、信号强度提升、灵敏度增强。Pakin等［11］对猪肝样品中的VB12进行 α-ribazole衍生化和碱性磷酸酶处理，使反应物具有荧光性质，测定用激发波长为250 nm，发射波长为312 nm，可进行HPLC-荧光色谱分析。方法回收率为95%，定量限3 ng/g。

2.3.2 氰化衍生法

构型转化的目的是让不同构型的VB12在KCN环境中衍生化成为氰钴铵素的形式，通过该衍生反应可以使不稳定的各类钴胺素转化成相对稳定的氰钴胺素［40－42］，为后期检测 VB12的总量提供有利条件。Fumio Watanabe等人［8］对贝类中 VB12使用了氰钴胺素转化方法进行分析，将贝类匀浆后和1%KCN一起煮沸处理进行转化，最后配合化学发光VB12检测法，方法的线性相关系数 r=0.99，变异系数为1.2% ～6.7%。这种转化法提高了VB12的热稳定性，也有利于反映出样品中VB12的真实含量。

3 展望

随着科学的发展，从VB12被发现至今，对其提取、分析等检测技术方面取得了很大进步。检测VB12的关键在于样品的前处理阶段:选用条件温和的酶水解法促进样品中VB12的释放，富集净化时可以利用固相萃取柱或免疫亲和柱的高度特异性吸附对VB12快速简便地富集，并根据固相萃取的类型，对萃取条件进行优化。在仪器分析阶段，可以使用高效而且定量准确的HPLC-UV进行分析。随着精密仪器制造技术的发展和高分子科学的进步，VB12的分析已经开始从微生物方法逐渐向仪器分析方法转变，随着前处理的手段不断进步完善，更多仪器分析方法和净化方法将会突破检测中VB12本底值低、样品杂质干扰大的瓶颈，使VB12的分析更加高效、准确。

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Progress on the Determination of Vitamin B12

Cui Ming，Yang Da-jin，Lu Jie，Wang Zhu-tian
Institute for Nutrition and Food Safty，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100021，China

Vitamin B12is a kind of water soluble vitamins.The amount of vitamin B12in food holds very low level and it is hard to measure because of the complexity of animal food.Analytical techniques were reviewed in the paper such as sample hydrolyzation，solid phase extraxtion，configuration transformation，as well as the focus on the detection method of Vitamin B12based on the study of vitamin B12at home and abroad.

food，enrichment and purification，vitamin B12，detecting method，review

硕士研究生(王竹天研究员、杨大进研究员为通讯作者)

*国家自然科学基金资助项目

2010－10－18，改回日期:2011－03－11