小叶锦鸡儿SSR-PCR体系优化及应用

韩永增，王 赞，高洪文

(1.兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

小叶锦鸡儿(Caraganamicrophylla)为豆科锦鸡儿属多年生饲用灌木，多分布于中国东北及内蒙古、河北、山西、陕西等地，蒙古、西伯利亚也有分布[1]。因其耐干旱、低温，能抗风沙，再生力强，耐瘠薄等特性而成为良好的饲用灌木和生态保护先锋植物。微卫星DNA(Microsatellite DNA)Simple sequence repeats(SSR)， 是一种基于DNA长度多态性的分子标记技术，具有共显性、高度可重复性及多态性丰富等优点，是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析和法医鉴定的理想工具[2-7]。目前国外已经应用该技术对很多物种进行了遗传多样性及遗传结构分析研究[8-11]，国内在牧草上也有部分应用[12-13]，但在小叶锦鸡儿上应用SSR标记的研究却很少[14]。其主要原因就是缺少用于小叶锦鸡儿SSR分子标记的引物，而本研究所采用的引物为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室自行开发的SSR引物，并利用正交试验设计，对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶浓度进行五因素四水平优化筛选，从而建立高效、稳定的小叶锦鸡儿SSR-PCR反应体系，为SSR标记在锦鸡儿属植物的遗传多样性分析、遗传图谱构建、种质资源鉴定、亲缘关系分析及分子育种等研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 供试材料为24份小叶锦鸡儿种质资源，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草种质库提供，1号为体系优化模板，其他均为检测模板(图1)。

1.2方法

1.2.1DNA提取及检测 DNA提取技术采用CTAB法从小叶锦鸡儿种子中进行提取[15]，用1%琼脂糖电泳检测其质量，用UNICO UV-2000型分光光度计检测其浓度，所有DNA样品稀释到50 ng/μL。

1.2.2反应体系优化 针对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶等5种影响因素进行L16(45)正交实验(表1和表2)。引物为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室开发的“S1-25”(待发表)，由上海英骏生物技术有限公司合成。反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性45 s，65℃复性1 min，72℃延伸1 min，10个循环，每循环的复性温度递减1℃；94℃变性45 s，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存[16]。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺分离及银染检测[17]。

1.2.3优化体系的最终确定 在正交试验的基础上又做了Mg2+和Taq DNA聚合酶的四水平完全正交试验，以确定最佳的反应体系，其设计见表3和表4。结果用1%琼脂糖电泳检测。

图1 小叶锦鸡儿种子DNA电泳图

表1 SSR-PCR体系的正交设计因素及水平

表2 SSR-PCR体系正交试验设计[L16(45)]

表3 Mg2+和Taq DNA 聚合酶的四水平

表4 Mg2+和Taq DNA聚合酶完全正交设计

2 结果与分析

2.1DNA提取质量 用CTAB法提取的小叶锦鸡儿基因组DNA完整，无降解，且无RNA残留。用紫外分光光度计检测，OD260/OD280值符合SSR分子标记的要求(图1)。

2.2SSR-PCR正交设计结果及分析 根据SSR-PCR正交试验结果(图2)可以清晰地看出，这16个组合中，7、8两组条带清晰明亮且没有杂带，而这两组只有DNA的量是相同的，所以要确定其他影响因素的量还要经过进一步的分析。依据前人研究[18]可知，引物与模板结合后在Taq酶作用下进行延伸，Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，受Mg2+浓度的影响，而Mg2+又受dNTP的拮抗作用。所以，现在只需将dNTP与引物的量固定，设计Mg2+与Taq酶的完全正交试验即可得到最佳的优化体系。出于成本考虑，本试验选择dNTP水平较低的第8组合作为基础。从Mg2+与Taq酶的完全正交试验结果可以看出(图3)，Taq酶的量对体系影响不显著，而Mg2+的量对体系影响十分显著。因表4第15组合与表2第8组合完全相同，所以可以确定条带最亮的第12组合为最佳体系，即：40 ng模板DNA，3 mmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTP，0.6 μmol/L引物，1 U DNA聚合酶，1×Buffer，加dd H2O至25 μL。

图2 SSR-PCR正交设计扩增结果

图3 Mg2+和Taq DNA聚合酶完全正交设计扩增结果

2.3优化体系应用 利用优化的PCR体系对其余种质资源进行扩增，条带清晰明亮且特异性强(图4)，证明此体系具有较好的稳定性和可重复性，同时也表明小叶锦鸡儿种质资源具有较高的遗传多样性，可以应用该优化体系对其进行多样性分析研究。应用本优化体系对自行开发的其他SSR引物进行PCR筛选，共得到有效扩增引物37对，根据其多态信息含量(polymorphism information content,PIC)可知，多态性引物21对(56.8%)(其部分结果见图5)，证明此体系也具有较好的广泛应用性。

图4 优化体系对所有小叶锦鸡儿种质资源的扩增结果

图5 引物S1-13对所有小叶锦鸡儿种质资源的扩增结果

3 讨论

随着分子标记技术的不断发展完善，SSR标记也因具有很多优良特性而被广泛应用，尤其是在优良牧草上的应用将更加深入。因影响SSR-PCR的因素很多，且各个因素相互影响[18]，所以应用正交设计这一实用工具将大大提高工作效率。通过本研究优化出的扩增体系表现出良好的稳定性和广泛性，可为今后的科研工作提供参考。

本研究表明，Mg2+的浓度对SSR-PCR体系的影响十分明显，这与前人的结论一致[19]，因此在本研究中参照张丽芳等[20]SSR优化方法再设计一组二因素四水平完全随机试验，逐个优化其他反应成分以确定最佳的反应组合。本次SSR-PCR体系的优化从更多方面进行开展，能为今后的科研工作提供帮助。但还有些不足，如PCR仪的不同对体系的影响，聚丙烯酰胺凝胶的浓度对产物的分离效率及不同的点样量对分离效果的影响等问题还有待进一步研究。

本研究所选的PCR程序为Gharghani等[16]的程序，而这一类型的程序在不同的物种当中已有广泛的应用，如韩香婷[21]、曹永国[22]、Tang等[23]分别在大白菜(Brassicapekinensis)、玉米(Zeamays)及资源冷杉(Abiesziyuanensis)中都应用此类程序完成了SSR分子标记工作。该程序的优点是不改变任何参数即可将不同引物进行扩增，大大节省了退火温度的检测时间和成本。该类程序可为今后的SSR标记工作提供帮助。

依据优化的PCR体系对所设计的SSR引物进行筛选，结果有5对(11.63%)得到扩增，但没有一致性，也与目的片段相差很大，有1对(2.32%)没有扩增产物，其原因可能为设计引物时所选用的序列为基因突变的片段，另外也有可能是测序过程中的碱基错误影响了引物设计，进而影响了PCR扩增。本研究共得到多态性引物21对，其余引物也可能存在多态性，只是因为用于检测的个体数较少而没有表现出多态性，这些引物的多态性检测将在今后的工作中进行。

4 结论

1)采用正交设计和完全正交试验优化了小叶锦鸡儿SSR-PCR反应体系，其最适的反应体系为(25 μL)：40 ng模板DNA，3 mmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTP，0.6 μmol/L引物，1 U Taq DNA聚合酶，1×Buffer。

2)利用上述优化体系对小叶锦鸡儿种质资源进行检测，证明该体系具有较好的稳定性和可重复性；应用该体系对自行开发的SSR引物进行筛选，得到有效扩增引物37对，其中多态性引物21对，占56.8%，证明该体系具有广泛的应用性。

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