高效液相色谱法测定小鼠血浆中黄芩苷含量及其药代动力学研究

王 丽，周慧芳，张艳军，庄鹏伟

(天津中医药大学，天津 300193)

黄芩苷为黄酮类化合物，是唇形科植物黄芩的主要有效成分之一，其含量较多，属葡萄糖醛酸苷化合物，并具有广泛的药理作用,如抗炎、抗病毒、保肝和解热等[1]。近些年，通过大量的实验证明，黄芩苷还具有抗实验性心律失常、抗肿瘤、抗氧化作用和对钙离子的作用等。黄芩苷在临床上应用广泛，现已被研制出多种剂型。研究黄芩苷在体内代谢过程对其药效机理和临床用药具有重要的指导作用。本实验运用高效液相色谱法，测定黄芩苷在小鼠血浆的浓度变化规律并进行药代动力学分析[2-4]。

1 材料

1.1 对照品 黄芩苷对照品，中国药品生物制品鉴定所，批号07159708。

1.2 试剂 甲醇(色谱纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司)；乙腈(色谱纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司)；磷酸(分析纯，天津市化学试剂三厂)；色谱分析用水(娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)；肝素钠注射液(天津市生物化学制药厂，批号H12020505)；乙醚(天津化学试剂厂)。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，雄性，体质量(25±2)g,天津市山川红实验动物科技有限公司提供。

1.4 仪器 SOFTA6000高效液相色谱系统;KQ-100A型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);XS204分析天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法学考察

2.1 色谱条件 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(含0.05%的磷酸)(75∶25, V/V)，检测波长278 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量20 μL。

2.2 对照品储备溶液的配制 用甲醇配制浓度为100 μg/mL的黄芩苷对照品溶液。

2.3 血浆样品预处理 取小鼠血1 mL至肝素钠试管中,离心后得空白血浆。取空白血浆100 μL，加入400 μL甲醇，于微型旋涡混合仪混合30 s，10 000 r/min离心，取上清液，氮气吹干，加入300 μL甲醇涡旋混合，取20 μL进样。

2.4 标准曲线的制备、最低检测限与定量限考察 取黄芩苷对照品储备溶液,配制成黄芩苷25、5、1、0.25、0.1、0.05、0.025 μg/mL的系列溶液,分别进行测定。以峰面积(Y)对浓度(X)作线性回归，得线性范围和回归方程，见表1，图1。

图1 黄芩苷的标准曲线

取对照品溶液,以流动相稀释,按“1.2.1”项下色谱条件测定。以信噪比等于10计算,黄芩苷的最低定量限为0.036 87 μg/mL。

表1 黄芩苷线性关系

2.5 精密度试验 配制黄芩苷低、中、高3个浓度的对照品样品混合溶液，按“血浆样品预处理方法”处理样品，分别进行测定。同一浓度每隔1 h测定1次，测5次,计算日内精密度；每隔1 d测定1次，测5 d，计算日间精密度。结果见表2。

表2 血浆样品中的精密度

试验结果表明,黄芩苷的低、中、高3种浓度在血浆中的日内、日间精密度均符合要求。

2.6 回收率试验 配制黄芩苷低、中、高3个浓度的对照品混合溶液，按“血浆样品预处理方法”处理样品，分别进行测定。按照对照品测得量和加入量之比计算回收率。结果见表3。

表3 血浆样品中的回收率

试验结果表明，黄芩苷的低、中、高3种浓度在血浆中的回收率符合要求。

2.7 稳定性试验 取黄芩苷对照品储备液，45 ℃以下氮气吹干，加入200 μL空白血浆，配制成血浆样品中含黄芩苷1 μg/mL的溶液，按“血浆样品预处理方法”处理样品，将所配药液于冰箱中冷藏，分别在0、1、2、4、6、8 h进行测定。以对照品测得量计算相对标准偏差。结果见表4。

表4 血浆样品中的稳定性

试验结果表明,黄芩苷的低、中、高3种浓度在血浆及脑组织中8 h的稳定性符合要求。

图2 黄芩苷对照品色谱图

图3 空白血样色谱图

图4 加药后血样色谱图

2.8 专属性试验 在1.2.1项下的色谱条件下, 测定黄芩苷对照品、空白血样及加药后血样，见图2～图4。

由图可知黄芩苷的保留时间约为6 min,空白脑组织中的内源性物质不干扰黄芩苷在脑组织中浓度的分析。

3 样品的测定及药动学参数计算

3.1 黄芩苷在正常小鼠血浆中浓度的测定 健康小鼠60只，随机分组,每组设置10个取样点，每个取样点6只小鼠。正常小鼠给药前禁食不禁水12 h，按25 mg/1 000 g的剂量尾静脉给予黄芩苷，分别于给药后的5、15、30、60、90、120、180、240、360、480 min[5]采血0.5 mL左右，离心，取血浆。打开小鼠胸腔，用生理盐水从左心室灌注，取脑组织(每一时间点取一只小鼠)。称重后置玻璃匀浆器中匀浆。按“血浆及脑组织样品预处理方法”处理样品，进行测定。以峰面积计算黄芩苷在正常小鼠血浆和脑组织中不同时间的药物浓度数据见表5，其药物浓度-时间曲线见图5。

图5 黄芩苷在正常小鼠血浆中的药-时曲线

表5 黄芩苷在正常小鼠血浆及脑组织中的血药浓度

3.2 黄芩苷在正常小鼠体内的药代动力学参数 采用中国药理学会数学药理委员会编制的DAS1.0实用药代动力学软件处理血药浓度数据,分别按一二三室模型进行模拟，获得AIC值和相关系数r。根据AIC值最小和r值最大原则，判定黄芩苷在正常型小鼠血浆中的药-时过程均符合二室开放模型[6]。并求得其药代动力学参数，结果见表6。

4 讨论

在优化HPLC色谱条件时，本研究比较了乙腈、甲醇等溶剂与水按不同比例混合及磷酸的浓度配制成流动相的分离效果,结果表明选用乙腈-水溶液(75∶25)含0.05%的磷酸[7]为流动相可以很好地分离黄芩苷，且峰型较好、保留时间恰当,分离效果良好,血浆内源性物质及其他杂质不干扰样品的分离测定。

表6 黄芩苷在正常小鼠血浆主要药代动力学参数(隔室模型,

H在优化萃取条件的过程中，本实验比较了甲醇、乙腈、高氯酸等溶剂的萃取效果，发现甲醇效果最好，黄芩苷峰形较好，且回收率较高，故选用甲醇对小鼠血清中的黄芩苷进行萃取。

本实验建立了高效液相色谱法测定小鼠血浆中黄芩苷含量的方法，实验证明，本方法能够有效地测定药物在血浆中含量的变化情况及其药代动力学研究，灵敏度高，重现性好，操作简便快捷，对准确考察黄芩苷对大鼠药代动力学的作用具有指导意义。

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