生化汤合剂微生物限度检查方法验证实验研究

(广州市黄埔区食品药品检验所，广东 广州 510700)

生化汤合剂是广州市黄埔区中医院院内制剂，该制剂由益母草、当归、川芎、桃仁、牛膝等几味中药组成，具有活血逐瘀、养血止血功效，临床主要用于产妇产后血瘀腹痛、恶露不尽等症，疗效显著。本文按照《中国药典》[1]2010年版要求,对生化汤合剂的微生物限度检查方法进行了验证试验，并用此方法对3批该制剂进行检验。

1 材料与仪器

1.1 菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，白色念珠菌[CMCC (B) 98001]，黑曲霉菌[CMCC(B)98003]，均为中国药品生物制品检定所提供。

1.2 培养基 pH 7.0-氯化钠蛋白胨缓冲液(批号：090703)，营养琼脂培养基(批号:100826)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号：100520)，胆盐乳糖培养基(批号：100916)，营养肉汤培养基(批号：100625)，改良马丁培养基(批号：090202)，改良马丁琼脂培养基(批号：100622)，4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基(批号:090326)，均为北京三药科技开发公司生产。

1.3 供试品 生化汤合剂(规格：300 mL/瓶，广州市黄埔区中医院，批号：100514、100716、100721)。

1.4 仪器 电子天平(型号：JJ1000常熟市双杰测试仪器厂)；自动蒸汽灭菌器(型号：CL-32L ALP Co.Ltd Tokyo Japan)；电热恒温培养箱(型号：HH.B11.500上海跃进医疗器械厂)；生化培养箱(型号：LRH-150B广东省医疗器械厂)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10 mL营养肉汤培养基中,置于30～35 ℃培养箱培养24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,置于23～28 ℃培养箱培养48 h。上述各培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100 cfu/mL的菌悬液。接种黑曲霉新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，置于23～28 ℃培养箱培养7 d，加入5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱,吸取孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每含孢子数为50～100 cfu/mL的孢子悬液。

2.2 供试液的制备 取供试品10 mL，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL混匀，作为1∶10的供试液。

2.3 细菌、霉菌、酵母菌数测定方法的验证

2.3.1 试验组 分别取供试液和上述制备好菌悬液各1 mL，注入无菌平皿中，立即倾注琼脂培养基，其中加入大肠埃希菌菌液组、金黄色葡萄球菌菌液组和枯草芽孢杆菌菌液组分别倾注营养琼脂培养基，摇匀，待凝固后倒置于培养箱,30～35 ℃培养3 d,计数；加入白色念珠菌菌液组和加入黑曲霉菌液组分别倾注玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，待凝固后倒置于培养箱,23～28 ℃培养5 d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿。

2.3.2 菌液组 分别取上述各菌液1 mL，注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基培养,照试验组方法培养与计数。

2.3.3 供试品 对照组：取1∶10供试液1 mL，注入平皿中,照试验组方法培养与计数。

2.3.4 试验结果 方法验证试验进行3次独立的平行试验,并分别计算各组试验回收率。结果见表1。各次试验试验组的回收率均高于70%，符合规定。

表1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果

回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 试验组 取1∶10供试液10 mL和制备好的大肠埃希菌菌悬液1 mL，接种至100 mL已灭菌的胆盐乳糖增菌培养基中，于35 ℃培养18～24 h。

2.4.2 供试品组 取1∶10供试液10 mL，接种至100 mL 已灭菌的胆盐乳糖增菌培养基中，于35 ℃培养18～24 h。

2.4.3 阴性菌对照组 取1∶10供试液10 mL和制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液1 mL，接种至100 mL已灭菌的胆盐乳糖增菌培养基中，于35 ℃培养18～24 h。

2.4.4 阴性对照组 取pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL，接种至100 mL已灭菌的胆盐乳糖增菌培养基中，于35 ℃培养18～24 h。

2.4.5 取上述各组培养物0.2 mL，分别接种至各含5 mL MUG培养基的试管内，置于35 ℃培养箱培养，培养物分别于5、24 h置365 nm紫外灯下观察，观察结果后，沿各培养管管壁分别加入数滴靛基质试液，观察结果。

2.4.6 结果判断 方法验证试验进行3 次独立的平行试验，结果见表2。试验组检出大肠埃希菌，供试品组、阴性菌对照组、阴性对照组均未检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出阴性菌。

3 讨论

细菌、霉菌及酵母菌方法验证试验结果表明，生化汤合剂中的各中药成分无抑菌作用，可采用平皿法对其进行细菌、霉菌及酵母菌微生物限度检测方法检测。控制菌方法验证结果表明，采用常规法检查大肠埃希菌方法有专属性，不受其他菌的干扰。

《中国药典》2010年版规定当建立药品的微生物限度检查法时，需进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证,以确认所采用方法适合于该药品的检查[2]。当药物的生产方法变更、制剂组分发生改变、检查法修订或检验条件发生改变时,检查方法也应重新进行验证，尤其是中成药制剂,而不同药品的微生物验证方法不尽相同,故方法的设计至关重要[3]。本文介绍的微生物验证方法为中药制剂的微生物检查的验证提供了参考。

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:附录107-116.

[2]郑继明,朱婕妤.理气解郁合剂微生物限度检查方法验证[J].海峡药学,2010,22(10):75-77.

[3]汤大妹,汪健,赵勤,等.参味合剂微生物限度检查方法的验证[J].实用临床医药杂志,2010,14(1):69-70.