草麻黄补体抑制成分对大鼠急性脊髓损伤后补体表达的影响*

中国医科大学附属第一医院骨科(沈阳 110001) 李良满 李静波 朱 悦

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)继发性损伤机制复杂,目前临床上还缺乏更多有效的治疗药物。我们在前期的研究中发现,补体系统在 SCI中起到了重要作用,抑制补体系统激活可以减轻继发性 SCI[1]。近几年来,SCI的抗补体治疗越来越引起人们的关注。而开发寻找高效、安全、低成本的补体抑制剂亦成为相关研究热点和方向[2]。草麻黄(Ephedra sinica,ES)较早地被应用于急性肾炎、支气管哮喘等与免疫炎症反应相关疾病的治疗中,获得了显著的疗效,其作用机制被认为与抑制补体活化有关[3]。随着生物化学技术的不断发展,其抗补体成分已被成功的分离提取,并被证明具有强力的补体抑制作用[4]。本研究首次将草麻黄补体抑制成分应用于实验性的 SCI治疗中,探讨其对SCI后补体系统激活的影响,为 SCI的抗补体治疗提供更多的理论依据。

材料和方法

1 草麻黄补体抑制成分的提纯及活性鉴定 参照 Ling等的方法应用多步沉淀及薄层层析方法进行草麻黄补体抑制成分的提纯并进行活性鉴定,1kg草麻黄加入 pH4.0的蒸馏水 10L,煮沸 1h,过滤除渣,加入 1mol/L NaOH调整 pH至 9.0室温搅拌孵育 1h,离心,洗涤沉淀 3次,室温烘干得到棕褐色粗品共 18.5g。取 3g粗品溶于 pH4.0的蒸馏水 50ml中,煮沸 1h,离心弃上清,溶于 pH 9.0的蒸馏水中,调整 pH值至4.0,进行薄层层析,微量法进行补体溶血实验测定,结果证明最快速移动层析带具有显著的抗补体活性。重复以上步骤进行提取收集备用。

2 实验动物分组及脊髓损伤模型制备 健康 SD大鼠 50只,SPF级,雌雄不拘,体重 250～ 300g,随机分组:①实验组 (ES组):分脊髓损伤后 12h、1d、3d、7d、14d五个时间点,每个时间点 n=5,伤后 1h给予ES补体抑制成分提取物 (15mg/kg)溶于 5ml生理盐水强制灌胃,1次 /d。② 对照组(Control组):分脊髓损伤后 12h、1d、3d、7d、14d五个时间点,每个时间点 n=5,以同样方法给予等量生理盐水。采用改良的Allen’s重物打击法[5]方法制备大鼠脊髓急性损伤模型:损失部位为 T10节段。

3 血清总补体溶血活性测定 应用 CH50法进行血清总补体溶血活性测定。在大鼠 SCI前 1h、伤后12h及伤后每天尾静脉抽血 0.3ml,离心,取上清,-20℃保存备用。制备 2%绵羊红细胞悬液,溶血素效价测定,制备 50%溶血标准管,然后将各浓度梯度反应体系置于微量板孔中,反应完毕后,在 541nm波长处测吸光度,计算出待测血清的 CH50值,并与损伤前血清样品的基础值比较,计算出百分比值。

4 组织病理学观察 各组动物于伤后每个时间点各取 3只再次麻醉,以伤处为中心取 1cm脊髓组织,制作片厚为 12 μ m的冰冻切片,分别行 HE染色及免疫组织化学染色。采用 SABC法进行 C3、C9免疫组化染色。试剂盒购自美国 Sigma公司。光学显微镜下,C3及 C9阳性反应物为突出背景的棕黄色颗粒。应用Meta Morph全自动真彩色图像分析仪测定 C3、C9阳性反应物平均灰度值(Average gray value,AG)。 AG与阳性反应物的免疫反应强度呈反比关系。

结 果

1 血清 CH50测定结果 在实验组和对照组,伤后早期血清 CH50比值迅速下降,约在伤后 1d达到最低值,分别 29.05% ± 2.08%,24.08% ± 2.31%;伤后 3d至 7d快速上升,以后缓慢回升,在伤后 14d,对照组 CH50接近伤前水平(98.21% ± 1.12%),而在实验组仅达到伤前的 75%左右。在伤后 12h实验组的 CH50比值均低于对照组,具有显著性差异(P＜0.05),而在此后的几个时间点,实验组的 CH50比值均明显低于对照组(P＜0.01)。

2 组织病理学检查结果 伤后 12h,实验组及对照组脊髓前角部分神经元细胞膜上有散在的 C3及 C9阳性颗粒沉积;伤后 3d:两组整个灰质及白质内有大量 C3及 C9阳性颗粒沉积,其中残存阳性神经元的胞膜及胞浆内均可见 C3及 C9阳性颗粒沉积;伤后 7d,两组灰质内仍有一定数量 C3及 C9阳性神经元,部分神经元已基本恢复了多角形态;损伤后 14d两组灰质内仍可见 C3及 C9阳性表达。

3 图像分析结果 在伤后各个时间点,实验组脊髓损伤组织中 C3及 C9 AG值均高于对照组,且有非常显著性差异(P＜0.01),表明实验组 C3及 C9阳性表达明显弱于对照组;伤后 3d约是补体免疫反应的高峰,见附表。

附表 伤后不同时间点 ES组及 Control组 C3、C9表达图像分析结果 (AG

附表 伤后不同时间点 ES组及 Control组 C3、C9表达图像分析结果 (AG

注:与 Control组比较,* P＜0.01

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讨 论

补体系统是构成机体免疫防护机制的重要组成部分,也是造成病理性损伤的重要因素。中枢神经系统损伤时存在补体系统激活的必要条件。补体系统重要固有成分 C3处于经典途径、旁路途径及 MBL途径的汇合点,在补体系统激活过程中起着枢纽作用。 C9是形成膜攻击复合体(Membrane attack complex,MAC)的最后一个分子,也是补体系统激活并攻击破坏靶细胞的主要成分[6]。

补体系统激活后,会通过多种机制导致组织细胞的病理性损伤。其中 MAC所介导的神经元死亡包括坏死和凋亡两个方面。当 M AC攻击靶细胞膜时,在靶细胞膜上可形成小的双向的跨膜通道,引起 Ca2+不可抑制性地大量内流以及细胞内 K+外流、Na+通透性增加等变化,导致膜磷脂的过氧化,加重血管痉挛、组织缺血,神经元细胞传导冲动的能力减弱或丧失。 MAC还可以通过激活和裂解 caspase途径而诱导细胞调亡,从而加重继发性 SCI[7]。

近年来大量研究表明,抑制补体系统激活可以减轻 SCI后的继发性损伤,抗补体治疗有望成为 SCI新的治疗策略。 Reynolds[8]等研究发现痘病毒补体调控蛋白能够显著抑制大鼠 SCI后的补体表达,减轻 SCI。Qiao等研究表明,补体经典途径与旁路途径在脊髓损伤中起到重要作用,补体抑制剂 CR2-Crry能够显著地减轻小鼠 SCI后的神经功能损害,抑制补体激活可减轻继发性 SCI[9,10]。Tei等[11]研究发现,补体 C1酯酶抑制剂能够显著抑制补体系统激活,保护神经功能。Guo等[12]研究发现,C3缺失小鼠伤后神经元再生功能要显著优于 C3未缺失小鼠,抑制补体激活可减轻继发性SCI。我们研究发现,重组补体抑制剂 sCR1可显著抑制大鼠脊髓损伤后的补体激活,对神经功能发挥显著的保护作用。

本研究首次将 ES补体抑制成分提纯后应用于大鼠的 SCI模型研究中。结果表明,在实验组及对照组的SCI组织中均有重要补体固有成分 C3及 C9的表达,并且实验组的血清 CH50比值、损伤组织中的 C3及C9表达均明显低于对照组,表明 ES补体抑制成分能够显著抑制补体系统的激活,对脊髓损伤后的神经功能可能发挥重要的作用,在今后的研究中我们将进一步深入探讨。本研究为 SCI的抗补体治疗提供了新的实验数据及理论基础。

[1] 李良满,朱 悦 ,范广宇.重组可溶性补体受体 I型对大鼠急性脊髓损伤后神经功能的影响 [J].陕西医学杂志,2005,34(3):261-264.

[2] MollnesTE, Jokiranta T S, Truedsson L,et al.Complement analysis in the21st century [J].Mol Immunol,2007,44(16):3838-3849.

[3] Liu Y,LuoJ,He F.Experimental study on antiinflammatory effects of mahuang decoction and its compositions[J].Zhong Yao Cai,2005,289(5): 413-415.

[4] Yamada I,Goto T,Takeuchi S,et al.Mao(Ephedra sinica Stapf) protectsagainstD-galactosamine and lipopolysaccharide-induced hepatic failure[J].Cytokine,2008,41(3):293-301.

[5] Lee BH,Lee KH,Kim U J,et al.Injury in the spinal cord may produce cell death in the brain[J].Brain Res,2004,1020(1-2):37-44.

[6] Nguyen HX,Galvan M D,et al.Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cordinjury[J].JNeuroinflammation,2008,5(3):26-31.

[7] Swarup V,Ghosh J,Das S,et al.Tumor necrosis factor receptor-associated death domain mediated neuronal death contributes to the glial activation and subsequent neuroinflammation in Japanese encephalitis [J].Neurochem Int,2008,52(7):1310-1321.

[8] Reynolds DN,Smith SA,Zhang YP,et al.Vaccinia virus complement control protein reduces inflammation and improves spinal cord integrity following spinal cord injury[J].Ann N Y Acad Sci,2004,1035(1):165-178.

[9] Qiao F,Atkinson C,Song H,et al.Complement plays an important role in spinal cord injury and represents a therapeutic target for improving recovery following trauma[J].Am J Pathol,2006,169(3):1039-1047.

[10] Qiao F,Atkinson C,Kindy M S,et al.The alternative and terminal pathways of complement mediateposttraumatic spinal cord inflammation and injury[J].Am J Pathol,2010,177(6):3061-3070.

[11] Tei R,Kaido T,Nakase H,et al.Protective effect of C1 esterase inhibitor on acute traumatic spinal cord injury in the rat[J].Neurol Res,2008,30(7):712-717.

[12] Guo Q,Li S,Liang Y,et al.Effects of C3deficiency on inflammation and regeneration following spinal cord injury in mice[J].Neurosci Lett,2010,485(1):32-36.