不同聚合度柿子单宁对眼镜蛇毒的解毒作用

徐淑芬，田 燕，杨 杰，杨 立，李春美

(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430070)

据统计，全世界有剧毒的眼镜蛇的咬伤死亡率高达90%以上，而目前蛇毒的解毒药物主要可分为抗蛇毒血清、化学解毒剂、植物药、抗蛇毒蛋白4类。其中植物药由于资源广泛，生产技术相对简单以及成本较低而受到各国学者的关注［1］。柿子是我国的传统特色果品，柿子单宁具有抗氧化、抗肿瘤、解蛇毒等多种活性。植物单宁的生物活性与其聚合度紧密相关，由于柿子高分子量单宁是复杂混合物，其解蛇毒活性与聚合度的关系尚不清楚。本文研究了柿子单宁对眼镜蛇蛇毒蛋白中酶活的抑制情况。并通过体内试验研究单宁对染蛇毒小鼠存活时间的影响。旨在为深入研究柿子单宁的药理作用，开发出安全有效的解蛇毒药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1原料与试剂罗田柿子购于华中农业大学农贸市场，眼镜蛇毒蛋白粉购于浙江义乌市蛇类研究所，用SPF级昆明小鼠腹腔注射LD50为0.511 mg·kg-1。甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、β-巯基乙醇、四甲基乙二胺等购于美国Sigma公司，其它试剂均属于国产分析纯。

1.2动物SPF级，昆明种小鼠，体质量(20±2)g，♀♂各半，购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心［湖北实验动物质量合格证:SCXK(鄂)2008-0005］

1.3柿子单宁的制备按本实验室的提取工艺，制得高分子量柿子单宁［2］，采用香草醛-硫酸法和蛋白质沉淀法对提取物中单宁的含量进行测定，含量均在95%以上。用Toyopearl HW-50F凝胶树脂吸附后分别用体积分数为0.20、0.40和0.60的丙酮水溶液洗脱。依次分别收集后浓缩并冷冻干燥，得到3个柿子单宁级分，分别记为PT20、PT40、PT60。经硫解法［3］测定各个组分的平均聚合度(mDP)分别为2.61、23.27、33.37。

1.4柿子单宁对眼镜蛇蛇毒蛋白中各种酶活力的影响用pH 7.6，浓度为0.05 mol·L-1的Tris-HCl缓冲液配置浓度为1 g·L-1的眼睛蛇毒溶液。将蛇毒溶液与单宁各级分溶液按不同的质量比20∶1、5∶1、1∶2混合，37℃保温反应1 h，以10 000 r·min-1离心10 min，得到上清液备用。参考顾海峰等［4］的方法测定各上清液中磷脂酶A2酶、L-氨基酸氧化酶和乙酰胆碱酯酶活力。取20∶1、1∶2混合反应上清液分别记为S1和S2，沉淀分别记为C1和C2，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.5柿子单宁对染眼镜蛇毒小鼠致死毒性的影响昆明小鼠50只，♀♂各半，按体重随机分成正常组，蛇毒组，单宁低、中、高剂量组(0.5、1.5、4.5 mg·kg-1)，每组 10 只。正常组腹腔注射生理盐水，蛇毒组注射3 LD50眼镜蛇毒溶液，给药组先注射3 LD50的蛇毒溶液，再立即注射等量的单宁溶液作为中剂量组，给药组低、中、高剂量比为0.3∶1∶3。观察24 h内小鼠的死亡症状和死亡时间。

2 结果

2.1柿子单宁对眼镜蛇蛇毒蛋白中各种酶活力的影响以眼镜蛇粗毒中3种酶的活力分别为1计，不同聚合度、不同添加量的柿子单宁对蛇毒中3种酶活力的影响如Tab 1所示。随着单宁含量增加，酶活降低，且呈明显的剂量效应关系。这可能是由于随着单宁浓度的增加，单宁与蛋白质结合方式和位点也会发生变化。当蛇毒与单宁质量比为1∶2的时候，酶活几乎受到完全抑制。随着聚合度的增加，PT20对酶活的抑制效果最差，PT40和PT60对酶活抑制效果相差不大，这可能是因为随着聚合度增加，单宁与酶蛋白结合越强，当单宁分子量增加到一定的程度后，单宁对酶蛋白抑制程度受单宁分子量影响不大。

Tab 1 Inhibition of enzyme activity of Naja venom by PT fractions with different mean degree of polymerization

选择PT40做SDS-PAGE电泳分析。粗毒液与1∶2沉淀中的蛋白质电泳图几乎完全一致，上清液中各组分蛋白质随着单宁的增加颜色变淡，到1∶2的时候，上清液电泳图中几乎无蛋白质存在，表示当蛇毒与单宁质量比为1∶2时，PT40对蛇毒蛋白质沉淀效果较好。

2.2柿子PT40对眼镜蛇毒染毒小鼠的体内解毒实验模型组小鼠在注射蛇毒5～10 min后，运动失调，心跳加速，呼吸困难，眼睑下垂，死亡前身体剧烈抽搐。给药后，染毒死亡小鼠的平均存活时间明显延长。但是单宁和蛇毒完全作用后，仍有蛇毒对机体造成损害，但是中毒症状得到明显的减轻。

Tab 2 In vitro detoxifying effects of the PT 40 against Naja naja venom in mice

3 讨论

单宁与蛋白质的结合是其最重要的特征，单宁要与蛋白质形成稳定的复合体，其分子量是一个重要因素。本实验研究表明，当眼镜蛇毒与不同聚合度的柿子单宁以不同的质量比混合时，随着单宁含量的增加，蛇毒中的磷脂酶A2、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶酶活都受到了很大程度的抑制，且呈明显的剂量效应关系，同时抑制效果随单宁聚合度增加而增强。体内试验也证明给药组的小鼠死亡时间延长，存活率也提高，这说明注射柿子单宁对眼镜蛇毒引起的毒害有一定的抑制作用。Borges等［7］曾报道芭蕉汁在体外对响尾蛇蛇毒蛋白中的磷脂酶A2、出血毒性、肌肉毒性都有抑制作用，但是在体内先注射蛇毒后，再注射药物却没有解毒效果。这种差异可能是由于蛇毒的种类不同以及植物多酚与蛇毒的结合方式不同所造成的。柿子单宁与蛇毒蛋白质的结合机制和选择性及其解蛇毒作用的药理学机制还有待深入的研究。

［1］李金荣，蓝 海.中西药结合治疗蛇毒咬伤的新进展［J］.蛇志，2006，18(2):130-4.

［1］Li J R，Lan H.New research about the cooperation of Chinese and Western medicine cure snakebite［J］.J Snake，2006，18(2):130-4.

［2］顾海峰，李春美，徐玉娟，等.柿子单宁的制备及其抗氧化活性研究［J］.农业工程学报，2007，23(5):241-4.

［2］Gu H F，Li C M，Xu Y J，et al.Preparation and antioxidant activity of tannin from persimmon pulp［J］.Transact CSAE，2007，23(5):241-4.

［3］Chumei L I，Leverence R，John D T，et al.High molecular weight persimmon(Diosoyros kaki L.)proanthocyanidin:A highly Galloylated，A-linked Tannin with an unusual flavonol terminal unit，myricetin［J］.J Agric Food Chem，2010，58(16):9033-42.

［4］顾海峰，梁晋鄂，李春美，等.柿子单宁对几种蛇毒中主要酶的抑制作用及其机理初探［J］.中国农业科学，2008，41(3):910-7.

［4］Gu H F，Liang J E，Li C M，et al.Study on inhibitory effects of persimmon tannins on activities of major enzymes from several snake venoms and its mechanism［J］.Sci Agric Sin，2008，41(3):910-7.

［5］Mahanta M，Mukherjee A K.Neutralizion of lethality，myotoxicity and toxic enzymes ofNaja kaouthiavenom by Mimosa pudica root extracts［J］.J Ethnopharmacol，2001，75:55-60.

［6］赵 祥，李怀斌，熊克仁.眼镜蛇毒对大鼠脊髓乙酰胆碱酯酶表达的影响［J］.蛇志，2005，17(4):233-6.

［6］Zhao X，Li H B，Xiong K R.Effect ofNaja najaatra venom on expression of acetylcholine esterase in spinal cord of rats［J］.J Snake，2005，17(4):233-6.

［7］Borges M H，Alves D L F，Raslan D S，et al.Neutualizing properties of Musa paradisiacal L.(Musaceae)juice on phospholipase A2，myotoxic，hemorrhagic and lethal activities of crotalidae venoms［J］.J Ethnopharmacol，2005，98:21-9.