绵羊肺腺瘤PCR诊断方法的建立及应用

周艳喜，苏 佳，李 靖 ，刘霄卉，马学恩

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018）

绵羊肺腺瘤PCR诊断方法的建立及应用

周艳喜，苏 佳，李 靖 ，刘霄卉，马学恩＊

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018）

利用特异性PCR方法实现对绵羊肺腺瘤病毒（OPAV）快速精确诊断和病毒类型的分析。参照GenBank中公布的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列，针对病毒env基因YXXM基序设计了特异性PCR引物，建立了特异性PCR检测方法。成功扩增出病毒囊膜基因（env）多变区序列片段（ST）通过序列比对确定病毒类型。此方法操作简便，可用于绵羊肺腺瘤的快速诊断，可望在绵羊肺腺瘤发病机制等研究中起到重要作用。

绵羊肺腺瘤病毒；聚合酶链反应；检测

＊通讯作者

绵羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosis，OPA）是由绵羊肺腺瘤病病毒（Ovine pulmonary adenomatosis virus，OPAV）引起的一种肺肿瘤性疾病。以潜伏期长，咳嗽，呼吸困难，大量浆液性鼻漏，肺泡和支气管上皮肿瘤性增生和病死率高等为主要特征。在病羊的多个组织和羊奶中都可以检测到病毒粒子，小羊在食用患病母羊羊奶几个月后可感染本病［1］。各种年龄和品种的绵羊均能感染，但品种间的易感性有所差别，以美利奴绵羊的易感性最高。近年来也有几起关于山羊自然感染本病的报道。SPA呈世界性分布，在不同国家地区，SPA的发生率有显著差异，主要呈地方性散在性流行。当本病首次传入敏感羊群时，发病率可高达50%～80%，如冰岛从德国引进感染的公羊1年后，绵羊开始发病，在随后的2年～3年间，羊群中有60%的羊遭到感染和死亡。在此之后死亡率逐渐下降到10%以下，本病传入后的10年～12年仅有2%～3%的羊具有本病的典型病症［2］。

绵羊肺腺瘤病毒是Β反转录病毒。基因组为单链、线性、负股RNA，全长7 462bp。基因组中除gag、pro、pol、env基因外，在pol基因的3′端还有一个小的ORFX开放阅读框。JSRV感染宿主细胞后，在自身编码的反转录酶的作用下合成病毒DNA，并进一步形成前病毒DNA，在反转录过程中形成了前病毒基因组两端的长末端重复序列（long terminal repeat，LTR），前病毒DNA可以整合到宿主细胞基因组中，在宿主细胞染色体中以前病毒DNA的形式暂时或长期存在［3－4］。在绵羊山羊和大多数野生山羊属的物种基因组中都存在15拷贝～20拷贝的内源性绵羊肺腺瘤前病毒（endogenous OPAV，enOPAV）。与外源性反转录病毒核酸序列有很高的同源性［5－6］。JSRV的env基因是个活跃的基因能够引起细胞恶性转化［7］。env基因的YXXM基序是PI－3K调节亚基的结合位点。突变YXXM序列可以使env丧失引起细胞恶性转化的能力。近年的研究表明JSRV的env基因可能通过Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt两种不同机制引起细胞转化［8］。

目前，本病主要依赖于常规病理学诊断。本研究针对绵羊肺腺瘤内外源性病毒特征区设计引物，成功排除内源性性病毒的干扰，提高了诊断方法的准确性，可望在绵羊肺腺瘤诊断研究和应用中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样品 病羊肺脏组织由内蒙古农业大学兽医学院病理生理实验室保存，经病理剖检确定为绵羊肺腺瘤。临床检验用绵羊肺脏组织，外周血单核细胞基因组DNA均保存于内蒙古农业大学病理生理实验室。

1.1.2 试剂 Tissue/Blood DNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒为天根公司产品；pMD18－T、Premix ExTaqDNA 聚 合 酶、DNA Marker DL2 000等为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 应用primer premier 5.0软件针对env基因特征序列YXXM设计了一对引物。TF： TCATGTTGATACAAGGCCATA ，TR：TGTAACATATTTCTATATTTCAT。引物由上海英俊生物有限公司合成。扩增的目的片段命名为ST序列，扩增片段长度为886bp。

1.2.2 绵羊基因组DNA的提取 根据天根公司Tissue/Blood DNA提取试剂盒的操作步骤提取各样品基因组DNA，提取的DNA经紫外分光光度计检测纯度后置－80℃保存。

1.2.3 特异性PCR检测方法的建立 以提取的阳性病料基因组DNA和反转录的cDNA为模板，用引物TF和TR进行扩增，条件优化后获得的PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃30s，49℃30 s，72℃90s，进行40个循环；最后72℃延伸10min。1.2.4 阳性质粒的构建 PCR产物4.5μL，分别与pMD18－T载体0.5μL和SolutionⅠ5μL混匀，16℃连接过夜。转化感受态细胞DH5α，涂于Amp/IPTG/X－Gal固体LB平板37℃培养过夜，挑取白色菌落在LB培养液中过夜培养，将菌液PCR确定阳性克隆送北京三博公司测序。提取阳性菌质粒用紫外分光光度计检测质粒浓度及纯度。获得的重组质粒命名为ST－pMD18－T。

1.2.5 重复性和特异性试验 以标准阳性肺脏组织基因组DNA，构建的2株外源性病毒env质粒exenv1－pcDNA3.1、exenv2－pcDNA3.1和3株内源性env基因质粒 enenv1－pcDNA3.1、enenv2－pcDNA3.1和enenv3－pcDNA3.1为模板，用引物 TF和TR进行扩增，同时，设阴性对照，每个反应重复3次。

1.2.6 检测方法的应用

1.2.6.1 绵羊肺腺瘤流行区绵羊抽样调查 以2004年提取的某绵羊肺腺瘤发生区羊场绵羊基因组DNA样品30份为模板，扩增ST序列。并对扩增序列进行分析。

1.2.6.2 羊场绵羊肺腺瘤调查 随机采集某羊场成年绵羊血液50份提取基因组DNA，扩增ST序列进行检测。

1.2.6.3 人工感染羔羊感染情况的检测 人工感染羔羊10个月后部分小羊表现疑似SPA临床症状，抽取攻毒后第10个月小羊血液分离外周血白细胞，提取基因组DNA，扩增ST区序列，对羔羊病毒感染情况进行分析。

2 结果

2.1 目的片段的扩增

以标准阳性病料基因组DNA为模板，用引物TF和TR进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳图显示一条886bp的目的条带（图1）。

图1 特异性扩增产物Fig.1 Specific amplification products

2.2 目的序列的测定

将纯化的PCR产物连接pMD18－T载体转染DH5α感受态细胞，提取质粒送北京三博公司测序，测序结果表明目的片段大小886bp（图2），Blast比对结果显示目的序列与GenBank中登录的外源性绵羊肺腺瘤病毒株Y18303.1对应区域同源性为95.6%，与内源性绵羊肺腺瘤病毒AF153615.1对应区域同源性最高仅为84.8%。

图2 特异性PCR重复性试验Fig.2 Repeatability test of specific PCR

2.3 重复性和特异性试验

以标准阳性肺脏组织基因组DNA，构建的2株外源性病毒env基因表达质粒和构建的3株内源性病毒env基因表达质粒为模板进行扩增，并以健康羊基因组DNA为阴性对照（图3）。标准阳性样品和两株外源性env基因表达质粒均能扩增出特异性目的片段。3株内源性env基因表达质粒和阴性对照均不能扩增出特异性目的片段。

图3 Env基因质粒的PCR重复性试验Fig.3 Repeatability test of env gene plasmid

2.4 流行区抽样调查结果

以绵羊肺腺瘤发生区羊场的30份基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增，共检测出2份阳性样品（图4），绵羊肺腺瘤的感染率为6.7%，将阳性样品扩增序列连接pMD18－T载体，各挑取15个菌落进行测序。标准阳性样品和检测出的2个阳性样品的扩增序列ST可扩增出3种～4种不同序列。将序列进行比对，发现感染同一绵羊的病毒具有很高的同源性。在每个阳性样品中随机选取一个扩增序列，检测出的两个阳性样品扩增序列分别命名为ST2、ST3，标准阳性样品扩增序列命名为ST1，与GenBank登录的内外源性绵羊肺腺瘤病毒序列进行比对，发现感染不同绵羊的病毒的扩增序列在ST区也具有很高的同源性（图5）。

2.5 羊场绵羊肺腺瘤调查结果

对某羊场50只绵羊应用特异性PCR方法进行绵羊肺腺瘤诊断，均未扩增出病毒特异性片段。

2.6 羔羊人工感染试验结果

以羔羊攻毒后10个月提取的外周血白细胞基因组DNA为模板，用特异性PCR诊断方法检测病毒感染情况，攻毒的5只羔羊有2只羔羊检测为阳性，3只羔羊检测为阴性（图6），感染羔羊的病毒与羔羊攻毒用的病毒在ST区有很高的同源性。

图4 特异性PCR检测临床病例基因组DNA样品Fig.4 Detection of clinical cases genomic DNA samples

图5 扩增产物与各enJSRV和exJSRV代表株间核苷酸同源性分析和及基因系统发生树Fig.5 Percentage identity and phylogenetic tree for different strains of enJSRV and exJSRV nucleotide sequences

图6 特异性PCR检测羔羊基因组DNA样品Fig.6 Detection of lamb virus genomic DNA samples

3 讨论

Palmarini M等报道，外源性绵羊肺腺瘤病毒env基因胞质尾可能通过某种机制调节转化NIH 3T3细胞。胞质尾中的YXXM 基序是PI－3K调节亚基的结合位点，PI－3K是抑制细胞凋亡信号通路PI3K－AKT中的重要起始蛋白 。内外源性前病毒的基因高度相似，但在内源性env基因对应位置发生多处突变，不存在YXXM基序。这可能是内源性env基因不能引起细胞致廇转化的重要原因。本研究设计的特异性引物位于此区，可成功排除内源性病毒的干扰，保证了此诊断方法的特异性。

JSRV感染宿主细胞后，在自身编码的反转录酶的作用下合成病毒DNA，并进一步形成前病毒DNA。前病毒DNA转录时env基因可以形成独立的mRNA。本试验扩增的片段位于env基因内。因此，本方法可同时用于外源性绵羊反转录病毒前病毒形态和RNA形态时的检测。研究结果表明，本方法在检测前病毒DNA和转录的cDNA时都具有很高的灵敏度。用本方法对各类样品进行检测，标准阳性样品均可扩增出特异性片段，标准阴性样品未扩增出特异性片段。与病理剖检诊断结果一致。

绵羊肺腺瘤流行区的检测结果为JSRV的感染率仅为6.7%，可能的原因是该病毒的感染性不强或绵羊对该病毒已有很高的抵抗力。感染同一绵羊和不同绵羊的病毒在ST区都具有很高的同源性，可能的原因是这个地区绵羊的感染源是相同的，病毒在核酸水平上与Y18303.1和AF105220最相似。人工复制的绵羊肺腺瘤攻毒的5只羔羊中2只检测为阳性（感染率为40%），比国际上绵羊肺腺瘤人工复制成功率60%要低。可能的原因是此种病毒的感染性不强或羔羊的个体差异对该病毒的抵抗力不同。感染羔羊的病毒与羔羊攻毒用的病毒在ST区有很高的同源性。但基因序列不完全相同说明病毒在感染宿主期间发生了突变。

目前国内对绵羊肺腺瘤的诊断仍以病理组织学诊断、电镜观察病毒粒子诊断为主，尚无规范化通用的诊断手段。本研究首次针对env基因YXXM基序设计一对引物，引物序列在外源性绵羊肺腺瘤病毒序列中非常保守，可用于检验GenBank中登录的各类病毒毒株。扩增的目的片段包含env基因的多变区，可作为病毒类型分析的方法。与国内发表的PCR检测方法中针对某一毒株设计引物扩增病毒多变区的检测方法比较，本方法具有特异性强的特点，降低了绵羊肺腺瘤诊断中假阴性的发生率。本研究可作为检测绵羊肺腺瘤病毒检测和肺腺瘤普查的重要手段，同时为规范化的绵羊肺腺瘤诊断方法的研究提供了重要参考。

［1］ 马学恩.家畜病理学［M］.4版.北京：中国农业出版社，2007：385－386.

［2］ Wandera J G.Pneumonia in sheep in Kenia.PartⅠBacterial and parasitic pneumonia.Bulletin of epizootic disease of Africa［J］.Vet Microbiol，1967，15：245－248.

［3］ Holland M J，Palmarini M，Garcia G M，et al.Jaagsiekte retrovirus is widely distributed both in T and B lymphocytes and in phagocytes of sheep with naturally and experimentally acquired pulmonary adenomatosis［J］.Virology，1999，73：4004－4008.

［4］ Herring A J，Sharp J M，Scott F M，et al.Further evidence for a retrovirus as the aetiological agent of sheep pulmonary adenomatosis（jaagsiekte）［J］.Vet Microbiol，1983，8（3）：237－249.

［5］ Bai J，Bishop J V，Carlson J O，et al.Sequence comparison of JSRV with endogenous proviruses：envelope genotypes and a novel ORF with similarity to a G－protein coupled receptor［J］.Virology，1999，258：333－343.

［6］ Barsky S H，Cameron R，Osann K E，et al.Rising incidence of bronchioloalveolar lung carcinoma and its unique clinicopathologic features［J］.Cancer，1994，73：1163－1170.

［7］ Fan H M，Palmorini J C.Transformation and oncogenesis by Jaagsiekte sheep retrovirus［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2003，275：139－177

［8］ Kycko A ，Reichert M.Current views on the mechanism of oncogenic celtransformation in ovine pulmonary adenocarcinoma［J］.Postepy Hig Med Dosw ，2007，61：797－804.

Establishment and Application of PCR for Detection of Ovine Pulmonary Adenomatosis

ZHOU Yan－xi，SU Jia，LI Jing，LIU Xiao－hui，MA Xue－en

（VeterinarianInstituteofInnerMongoliaAgricultureUniwersity，Hohhot，InnerMongolia，010018，China）

Ovine pulmonary adenomatosis virus（OPAV）could be detected and identified by using specific PCR.The specific primers were designed according to sequences of OPAV in GenBank，and the sequence of YXXM was take into count in designing of primers.The result showed that sequence of variable area in gene env was amplified and the type of OPAV was idenfied.This spefic PCR assay repored here is a valuable and convenient method for detection of OPAV.The method will provide an important reference in the study of pathogenic mechanism of sheep pulmonary adenomatiosis.

Ovine pulmonary adenomatosis virus；polymerase chain reaction（PCR）；detection

S854.43

A

1007－5038（2011）10－0024－05

2011－04－25

国家自然科学基金（31060332）

周艳喜（1984－ ），男，天津宝坻人，博士研究生，主要从事动物分子病理学研究。