自由基氧化损伤与奶牛乳房炎关系的研究

尹柏双，李静姬，呼显生，崔永镇，宋 泰

（1.吉林农业科技学院动物医学学院，吉林吉林132101；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）

自由基氧化损伤与奶牛乳房炎关系的研究

尹柏双1，李静姬1，呼显生1，崔永镇2，宋 泰1

（1.吉林农业科技学院动物医学学院，吉林吉林132101；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）

研究乳房炎奶牛血清中自由基含量的变化，探讨奶牛乳房炎与氧化损伤的关系。将14头奶牛分为健康对照组和乳房炎组，分别在泌乳的不同时期静脉采血，分离血清，测定血清中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活性。结果表明，患病奶牛血清中ROS、MDA、NO含量极显著高于对照组（P＜0.01），NOS活性显著高于对照组（P＜0.05）。结果提示，患病奶牛血清中自由基含量的增加和活性的升高，可能是乳腺组织损伤的重要原因之一。

奶牛；乳房炎；自由基；氧化损伤

奶牛乳房炎不仅降低产奶量、影响牛乳的品质，使乳汁中细菌超标、并呈酒精阳性乳等，而且还会影响牛奶的营养成分和品质，有害人体健康［1］。奶牛乳腺组织是体内生化反应最复杂的组织之一，也是新陈代谢最旺盛的组织之一。大量泌乳使得乳腺分泌上皮细胞的代谢率增高，容易产生大量的氧化代谢产物，这些代谢产物过量蓄积于细胞内而不能及时清除，使得细胞最终老化、凋亡，引起局部炎症反应［1－3］。活 性 氧 （reactive oxygen species，ROS）与DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸（PUFA）作用，造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白－蛋白交联、蛋白－DNA交联和脂质过氧化，引起生物膜结构和功能的破坏，生物体氧化损伤［4］，从而引起慢性疾病［5－6］。因此，本试验从自由基氧化方面切入研究血清自由基与奶牛乳房炎的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 选择产奶量、胎次和泌乳期相近，营养中等怀孕黑白花奶牛，健康组（对照组）7只，乳房炎组7只，对照组与乳房炎组饲养管理条件完全相同，吉林市春光奶牛场提供。

1.1.2 主要试剂 活性氧（ROS）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、一氧化氮（NO）测试盒、一氧化氮合酶（NOS）测试盒，均为南京建成生物工程研究所产品。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理 两个试验组分别于泌乳后1、7、14、21、28、35 、42d，7个时期进行颈静脉采血，室温下（不超过20℃）自然凝固1h～2h，冰浴30 min，然后3 000r/min离心10min，分离血清，置－80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 血清自由基的检测 ROS含量的检测用化学比色法；NO含量的检测用硝酸还原酶法；NOS活性的检测用化学比色法；MDA含量的检测用硫代巴比妥酸法。具体操作方法参照各测试盒说明书。

2 结果

2.1 奶牛血清活性氧含量的变化

乳房炎组奶牛血清中活性氧含量在泌乳各时期均显著升高，与对照组比较，差异极显著（P＜0.01）（表1）。

2.2 奶牛血清NO含量的变化

乳房炎组奶牛血清NO含量在泌乳各时期均显著升高，与对照组比较，差异极显著 （P＜0.01）（表2）。

2.3 奶牛血清NOS活性的变化

乳房炎组奶牛血清NOS活性在泌乳各时期均显著升高，与对照组比较，差异极显著 （P＜0.01）（表3）。

2.4 奶牛血清MDA含量的变化

乳房炎组奶牛血清MDA含量在泌乳各时期均显著升高，与对照组比较，差异显著 （P＜0.05）（表4）。

表1 奶牛血清活性氧含量的变化Table 1 The change of active oxygen content in serum of dairy cows U/mL

表2 奶牛血清NO含量的变化Table 2 The change of NO content in serum of dairy cows μmol/mL

表3 奶牛血清NOS活性的变化Table 3 The change of NOS activity in serum of dairy cows U/mL

表4 奶牛血清MDA含量的变化Table 4 The change of MDA content in serum of dairy cows μmol/mL

3 讨论

自由基是指分子、原子或基团中有不配对电子的一类物质，因为他们都具有氧原子或氧分子，故又称为活性氧或氧自由基（ROS）。其反应能力特别强，可以攻击生物膜和组织的脂质、蛋白质［7］。NO也是一种自由基，参与氧自由基相互反应生成毒性更强的强氧化剂过氧化亚硝基阴离子（ONOO·）而介导细胞毒反应，因而NO对氧自由基的损伤效应起放大作用，促进炎症反应和组织损伤。NOS作为NO合成酶，其活性变化直接调节NO生成量及其生物学效应［8］。机体在代谢过程中产生的活性氧及其他氧自由基能攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物，脂质过氧化物在过氧化条件下是不稳定的，能分解生成有细胞毒性的丙二醛（MDA），损伤组织细胞。

炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应，病原菌一旦侵入乳腺，中性粒细胞和巨噬细胞即被动员起来，向乳腺移动，并吞噬这些侵入细菌。这时会出现氧消耗急剧增加的“呼吸猝发”现象，活性氧生成也随之增加，继而引发自由基反应，参与杀灭被吞噬的病原菌［9］。由此可见，中性粒细胞在吞噬细菌的过程中，细胞内会随之生成大量的过氧化物质。虽然，这些过氧化物质也参与杀灭细菌，但它也会对细胞和组织带来损伤，破坏细胞的正常结构，而且酶促反应产生的羟自由基（·OH）可导致溶酶体的溶细胞作用以及细胞膜脂质过氧化作用，使炎症进一步加重［10］。正常情况下，机体的抗氧化能力与不断产生的氧自由基的氧化能力之间保持着动态平衡，不会引起组织损伤，若自由基产生异常增多或机体的抗氧化能力下降，将导致组织的氧化损伤，引发疾病［11］。研究报道，心肌炎患者血清中内源性NO、MDA过量产生［12］；溃疡性结肠炎患者血、肠黏膜中NO明显增高［13］；狼疮性肾炎患者血中 NO、MDA明显增高［14］；肝炎、肝硬化患者自由基的水平有明显升高［15－16］；还有报道肾小球肾炎的发病机理与自由基代谢紊乱有一定关系［17－18］；以上研究结果表明自由基产生过量蓄积与疾病的发生有一定的关系。

本试验结果显示，乳房炎奶牛血清中ROS含量、NO含量和MDA含量极显著高于对照组，表明乳房炎奶牛机体存在自由基蓄积，并处于过氧化状态。这可能是由于奶牛乳腺受到感染，产生炎症时，中性粒细胞、吞噬细胞汇集到乳腺吞食入侵细菌，出现氧消耗剧增，活性氧生成增加，同时一氧化氮合酶活性增加催化NO大量生成，由于代谢过程中产生的大量活性氧和活性氮能够攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物及其分解产物MDA，导致机体及其乳腺组织细胞受到一定氧化损伤。本试验验结果提示，乳房炎奶牛乳腺组织受到氧化损伤，自由基参与了乳房炎的发生过程。

［1］ 赵克然，杨毅军，曹道俊.氧自由基与临床［M］.北京：中国医药科技大学出版社，2000：1－56.

［2］ Djordjevic V B.Free radicals in cell biology［J］.Int Rev Cytol，2004，237：57－89.

［3］ Valavanidis A，Vlahogianni T，Dassenakis M，et al.Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutant S［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2006，64（2）：178－189.

［4］ David P T，Gerard M J.The use of endogenous antioxidants to improve photoprotection［J］.J Photochem Photobiol，1997，41（B）：1－10.

［5］ Liu Zhongli，Wang Panfen，Liu Youcheng.Studies on bio－antioxidants［J］.Science in China.Series B，1992，35（11）：1307－1314.

［6］ Slater T F.Free radicals and tissue injury：fact and fiction［J］.Br J Cancer，1987，55：5－10.

［7］ Sargis R M，Subbaiah P V.Protection of membrane cholesterol by sphingomyelin against free radical－mediated oxidation［J］.Free Radic Biol Med，2006，40（12）：2092－2102.

［8］ 张 俊，桂永浩.一氧化氮和一氧化氮合酶与川崎病的研究进展［J］.国外医学：儿科学分册，2005，32（1）：12－14.

［9］ 陈主初.病理生理学［M］北京：人民卫生出版社，2001：93－94.

［10］ 苗明三.氧自由基、疾病与抗氧化中药［J］.河南中医药学刊，2002，17（4）：1－4.

［11］ Andreoli S P.Reactive oxygen molecules，oxidant Injury and renal disease［J］.Pediatr Nephrol，1991，5（6）：733－742.

［12］ 王 慧，王立金.心肌炎患儿血一氧化氮与氧自由基的变化及意义［J］.中国煤炭工业医学杂志，2006，9（1）：16－17.

［13］ 刘建生，田 怡，张晓红，等.溃疡性结肠炎与一氧化氮和氧自由基关系及丹参治疗作用研究［J］.中国医师杂志，2006，8（8）：1040－1042.

［14］ 姜 红，罗 钢，王淑兰，等.狼疮肾炎患者氧化损伤及抗氧化功能的评价［J］.中华风湿病学杂志，2003，7（3）：181－183.

［15］ Karageuzyan K G.Oxidative stress in the molecular mechanism of pathogenesis at different diseased states of organism in clinics and experiment［J］.Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2005，4（1）：85－98.

［16］ Ayaz M，Celik H A，Aydin H H，et al.Sodium selenite protects against diabetes－induced alterations in the antioxidant defense system of the Liver［J］.Diabetes Metab Res Rev，2006，22（4）：295－299.

［17］ Janisch K M，Milde J，Schempp H，et al.Vitamin C，vitamin E and flavonoids［J］.Dev Ophthalmol，2005，38：59－69.

［18］ Riccioni G D，Orazio N.The Role of selenium，zinc and antioxidant vitamin supplemen－tation in the treatment of bronchial asthma：Adjuvant therapy or not？［J］.Expert Opin Investig Drugs，2005，14（9）：1145－1155.

Study on Relationship Between Free Radical Oxidative Damage and Cow Mastitis

YIN Bai－shuang1，LI Jing－ji1，HU Xian－sheng1，CUI Yong－zhen2，SONG Tai1

（1.CollegeofAnimalMedicine，JilinAgriculureScienceandTechnologyCollege，Jilin，Jilin，132101，China；
2.HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin，Heilongjiang，150001，China）

The relationship between free radical oxidative damage and cow mastitis was studied by investigating free radical content in serum of mastitis cow.Fourteen cows were divided into control group and mastitis group.The content of ROS，MDA，NO and activity of NOS in serum of mastitis cow were measured by test kits.The results showed that the content of ROS，MDA，NO in serum were obviously higher as compared with control group（P＜0.01）.The activity of NOS in serum was obviously higher（P＜0.05）.The increasing of content and activity of free radical in serum of mastitis cows possibly is one reason of the damage in mammary gland.

cow；mastitis；free radical；oxidative damage

S852.3

A

1007－5038（2011）10－0050－04

2010－12－17

吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目（吉科2007232）；吉林农业科技学院青年基金项目

尹柏双（1978－），男，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士研究生，从事于动物疾病及动物麻醉学研究。