五鹤续断多倍体诱导的初步研究

武玉莲，韩 鸿，周海林，丁 莉，武 芸，*

(1.湖北民族学院 附属医院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；3.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000)

五鹤续断为川续断科川续断属植物川续断(DipsacusasperWall.)，具有耐严寒、喜湿润等特征，无病虫害等特点，是恩施州最佳道地药材之一[1].其干燥根具有续接筋骨、补肝益肾、抗骨质疏松和止血安胎等功效，临床上可用来治疗跌打损伤，骨折，腰膝酸软，腰椎骨质增生，先兆性流产和习惯性流产等症状[2-3].

开发药用植物资源的一个重要方面就是扩大和利用药用部位.五鹤续断的尾须和茎苗可开发成饲料产品.同时，五鹤续断还可开发用于煲汤及酒制剂，续断可药食通用，可开发成为良好的保健和功能食品.

五鹤续断组织培养已有报道[4-5]，但其多倍体诱导还未见报道.本研究采用秋水仙素对五鹤续断幼苗、萌发种子及其愈伤组织进行多倍体的诱导，为续断的药用成分的提取、品种改良及相关的科学研究提供依据，有一定的应用价值和理论价值.

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料五鹤续断来自湖北民族学院生物科学与技术学院苗圃.

1.2 多倍体诱导方法

1.2.1 不同浓度的秋水仙素溶液处理续断萌发种子 先将续断种子催芽，待露出根尖后，分别浸泡在不同浓度的秋水仙素溶液中处理不同时间，然后在流水下冲洗5～10 min，种在花盆(蛭石∶草炭=3∶1)中.

表1 不同浓度的秋水仙素对续断萌发种子不同的处理时间

表2 不同浓度的秋水仙素对续断无菌萌发种子不同的处理时间

表3 不同浓度的秋水仙素对续断幼苗不同的处理时间

表4 不同浓度秋水仙素处理续断萌发种子的多倍体的效应

1.2.2 不同浓度秋水仙素溶液处理续断无菌萌发种子 先将种子浸泡2～3 h，去除坚硬的果皮，在流水下冲洗2～3 h，在超净工作台上用75%的酒精泡0.5～1 min，在0.1%的升汞中处理6～8 min，用无菌水冲洗4～6次，接种在MS培养基上，待其长出幼根后，用不同浓度的无菌秋水仙素溶液处理相应的时间，秋水仙素处理环境为23℃黑暗条件下，处理完后用无菌水冲洗6～8次，将其种植在花盆(蛭石∶草炭=3∶1)中.

1.2.3 秋水仙素溶液处理续断幼苗 用脱脂棉吸取不同浓度秋水仙素溶液，覆盖在盆栽的具两个叶片小苗的叶间顶芽处，并用黑色透气薄膜包扎，以后每隔5 h用注射器滴加对应浓度的秋水仙素溶液，处理一定时间后，取下黑色透气薄膜，用清水冲洗放置棉球的地方.待顶芽生长30 d后取叶片表皮细胞进行形态学特性观察.

1.2.4 染色体检测 取经过诱导后的续断植株的根尖、茎尖和叶片，用孚尔根染色法鉴别细胞核中的DNA.取经过诱导的根尖、茎尖和叶片于0.05%秋水仙碱溶液中浸泡2.5 h左右；水洗后用乙醇∶冰醋酸(3∶1) 固定液固定6 h(一部分继续以下步骤，令一部分转入70%乙醇中冰箱保存)；再用水洗两次，投入试管，加入1 M盐酸溶液浸没材料，在60℃下水解10 min，待软化(明显变为半透明)，取出用蒸馏水换洗2次；在试管中加入希夫试剂，浸没材料，立即置于暗处处理1 h，然后用漂洗液换洗3次，每次2 min；分别取材料，置于载玻片上，滴一滴45%醋酸溶液，然后压片镜检.

2 结果与分析

2.1 不同浓度的秋水仙素溶液处理续断萌发种子多倍体的诱导

用不同含量的秋水仙素溶液浸泡处理五鹤续断种子后，种植在装有大黄土的花盆中.结果表明(见表4)，用0.2%的秋水仙素溶液处理42 h或48 h和0.3%的秋水仙素溶液处理36 h的外植体明显变肥变粗，诱变率均为100%.由此说明秋水仙素溶液的不同浓度和不同处理时间，对五鹤续断种子的萌发率和多倍体诱导率都有很大影响，但由于后期的培养使得处理材料全部死亡，有待重新考虑和找出是秋水仙素处理浓度和时间的原因还是生长环境造成的原因.

2.2 不同浓度的秋水仙素溶液处理续断无菌萌发种子多倍体的诱导

用不同浓度的秋水仙素溶液浸泡处理五鹤续断无菌种子，并接种在MS培养基上3 d后，胚根开始生长，以后子叶开始陆续伸展.从刚萌发的种子的形态观察，可以看出用高含量的秋水仙素溶液长时间的处理植物材料可提高多倍体诱变率，但选择适宜的秋水仙素溶液浓度和处理时间非常重要的.本研究从萌发的种子的形态观察选择用0.2%秋水仙素溶液处理42 h或48 h和0.3%秋水仙素溶液处理36 h的外植体明显变粗，变肥变粗率均为100%.待其生长30 d后取其根尖镜检，结果表明，对照组染色体数2n=18，与文献记载相符[6]，处理组细胞染色体数2n=36.

表5 不同浓度秋水仙素处理续断无菌萌发种子的多倍体效应

2.3 秋水仙素溶液处理续断幼苗

经诱变处理后的五鹤续断幼苗所产生的叶片在外观上与对照组有较大的差别.对照组叶片薄、叶面平整浅绿色并有一定韧性，表皮细胞易撕取，气孔和保卫细胞均小些；用0.2%的秋水仙素溶液处理42或48 h和0.3%的秋水仙素溶液处理36 h后具有明显的多倍体特征：叶片明显加厚，叶色深绿，叶面粗糙，脉纹加深，叶脆易折断，叶边缘常发生反卷.

3 讨论

选育药用植物优良品种是提高中药材质量和产量的有效途径.由于多倍体使药用植物染色体加倍，器官的“巨型性”特征，能较好地提高药材的产量；同时，加倍染色体上基因调控有效化学成分含量往往较正常二倍体高，因而多倍体也可提高药材的质量.但是，不同的材料对秋水仙素的敏感程度不同，即使是同一种材料，其浓度不同和处理时间不同对多倍体的形成影响很大.故选择适宜的秋水仙素浓度和处理时间对染色体加倍的诱导至关重要.张志胜等[7]用0.2%的秋水仙素溶液诱导处理红掌愈伤组织14 h，获得多倍体诱导率高达45.5%；王真等[8]用0.05%的秋水仙素处理萌动种子12 h，诱变率达11%，用0.1%的秋水仙素点滴法处理二倍体幼苗茎尖生长点48 h，诱变率达75%；王晓红等[9]用0.05%的秋水仙素溶液诱导处理非洲菊丛生芽12 h，诱变率可达38.46%；彭静等[10]用0.4%的秋水仙素溶液处理芽体48 h诱导率达18.64%.

用秋水仙素诱导植物多倍体的方式较多，本试验用五鹤续断种子的萌发条件下多倍体诱变，虽然开始诱导率较高，但诱导后的材料出现枯根性死亡，而且随着培养时间的延长，植物死亡程度越高；而采用幼苗茎尖秋水仙素处理诱变过程较好，幼苗生长情况也较好.用0.2%的秋水仙素溶液处理幼苗茎尖42或48 h和0.3%的秋水仙素溶液处理幼苗茎尖36 h的诱导率较高，诱导后植物材料具有明显的多倍体外形特征，是一种可取的诱导方法.

参考文献:

[1]武芸,丁莉,周吉源.五鹤续断的研究概况与开发前景[J].湖北民族学院学报:医学报,2004,21(4):31-33.

[2]全国中草药汇编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京:人民卫生出版社,2000：35-136.

[3]龚晓健,季晖,王青,等.川续断总生物碱对妊娠大鼠子宫的抗致痉及抗流产作用[J].中国药科大学学报,1997,29(6):459-461.

[4]武芸,武玉莲,张泽,等.五鹤续断快繁体系的建立和优化[J].时珍国医国药,2010,21(4):988-989.

[5]张泽,武芸.植物生长调节剂对五鹤续断组织培养的影响[J].湖北民族学院学报:自然科学版,2010,28(2):219-221.

[6]施波,雷盼,石开明,等.道地药材五鹤续断的染色体制片优化与核型分析[J].湖北农业科学,2010(1):129-131.

[7]张志胜,黎扬辉,姜蕾,等.红掌四倍体的离体诱导及其鉴定[J].园艺学报,2007,34(3):729-734.

[8]王真,陈道明,李春燕,等.半支莲多倍体诱导的初步研究及鉴定[J].广东农业科学,2010(8):74-77.

[9]王晓红,谭晓风.用秋水仙碱诱导非洲菊多倍体的研究[J].中南林业学报,2005,25(4):57-61.

[10]彭静,魏岳荣,盛鸥,等.不同浓度秋水仙素对贡蕉的多倍体诱导[J].分子植物育种,2010,8(4):752-757.