甘肃高寒阴湿地区蚕豆苗期镰刀菌根腐病病原鉴定

侯思雯，李敏权，杨晓明，杨发荣

（1.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院，甘肃 兰州 730070）

蚕豆（Vicia faba L.）别名胡豆、寒豆、佛豆、罗汉豆等，原产西南亚一带，是人类栽培的最古老的农作物之一。甘肃临夏地区高寒阴湿，地处青藏高原与黄土高原过渡地带，年平均气温6.3℃，降水量537 mm，无霜期157 d，适宜春蚕豆种植,是甘肃省乃至全国蚕豆生产的重要基地之一[1]。近年来，土传镰刀菌根腐病日益严重，成为蚕豆生产的主要限制因素之一。据报道,重病田蚕豆死亡率达60%～90%,甚至绝收[2]。蚕豆镰刀菌根腐病是一个世界性蚕豆病害，自1890年德国人Kirchmer报道以来，先后在美国、加拿大、意大利、苏丹、中国等国家见诸报道。我国自俞大绂等1944年报道以来，在云南、浙江、江苏、青海、甘肃等蚕豆栽培区均有病害发生及病原研究的报道，且多地报道的病原存在差别。本试验对甘肃临夏地区蚕豆苗期镰刀菌根腐病病原菌进行分离鉴定，旨在明确危害该地区蚕豆生产的病原菌种类，为今后蚕豆的抗病育种和病害防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 田间调查与样品采集

在蚕豆播种出苗后，分别于临夏县、康乐县田间调查并采集具有典型根腐病的病株。所采标本用聚乙烯袋保存，当天带回实验室分离。

1.2 病原菌的分离

采用常规的组织分离技术。将具有典型症状的蚕豆根经流水冲洗12 h，再从病健交界处切取0.5 cm大小的组织块，使用0.1%升汞溶液进行表面消毒1 min，用无菌水清洗3遍后，在灭菌滤纸上将水吸干，然后在无菌条件下置于PSA培养基平板上，25℃下培养。每天进行观察，待有肉眼可见的菌落出现时，取菌落前沿菌丝转皿，继续在25℃下培养备用[3]。

1.3 病原菌的纯化

经过培养的菌株，在显微镜下初步镜检，对已产孢的，直接进行单孢分离，对未产孢的经制作CLA培养基诱导产孢后进行单孢分离。置于PSA培养基25℃恒温培养箱中培养，4 d后测定菌落生长速率，观察并记录菌落培养性状、色泽等形态学性状[4-5]。

1.4 病原菌的鉴定

根据Booth.C和Lester B.分类系统[4-6]，将分离获得的菌株进行种的鉴定。

1.5 致病性的测定

蚕豆品种为临蚕七号，由临夏农科所提供。采用盆栽法和平皿法进行分离物的致病性测定。盆栽法：采用室内盆栽土壤接菌的方法,按灭菌土壤5%的菌量混土育苗，每盆5株。试验设3次重复，于一个半月后调查发病情况[7]。平皿法：在25℃下，将待测分离物在PSA培养基上恒温培养7 d后，打制直径为5 mm的菌饼，转入WA平板（150 mm）,25℃培养4 d，取蚕豆种子使用0.1%升汞溶液进行表面消毒1 min，灭菌水冲洗3次,均匀排列在带菌水琼脂培养基上,每皿10粒。试验设3次重复，以不接菌的WA培养基上同样处理10粒种子为对照，7 d后统计种子的发病率以及病情指数[8]。再从接种发病的植株上分离病原物，与鉴定并接种的菌株进行比较确认。

观察蚕豆胚根上的发病症状，病害共分5级：0级，健康无病；1级，幼苗胚根尖部位出现坏死斑点症状，但不软腐；2级，幼苗胚根上出现变软和腐烂症状；3级，坏死幼苗，萌发种子幼苗胚根腐烂；4级，霉烂坏死的种子或不萌发而腐烂的种子。发病率、病情指数的计算分别见式（1）、式（2）。

2 结果与分析

2.1 蚕豆根腐病田间症状表现

田间发病症状表现为发病植株生长缓慢，植株矮小，叶片发黄，植株下部叶片叶缘变黑，产生大小不等黑色枯斑，严重时整叶变黑焦枯，甚至植株死亡。病株地下部分主根和根颈病部位变黑，有缢缩。

2.2 病原菌分离

对66株田间根腐病株进行分离，共获得34个镰刀菌（Fusarium spp.）分离物,其分离频率达51.52%。

2.3 病原菌鉴定

如表1所示，所得病原镰刀菌分别是茄镰刀菌（Fusarium solani）、半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）和单隔镰刀菌（Fusarium dimerum）。病原菌的主要鉴定特征如下。

表1 蚕豆根腐病病原镰刀菌分离

2.3.1 茄镰刀菌（F.solani（Mart）Sacc.emend.Snyder&Hansen）在PSA培养基上，其生长速率为3.1 cm，PSA基物背面观察呈白色、近圆形、绒毛状，菌丝内有横膈膜，大型分生孢子数量多，马特形，顶部细胞钝圆，基胞足跟不明显；小型分生孢子数量多,椭圆形或卵形。厚垣孢子在菌丝中间产生，单瓶梗长。

2.3.2 半裸镰 刀菌 （F.semitectum Berk&Rav）PSA培养基上生长速率为3.45 cm，PSA基物背面观察初为白色，后至驼黄色，气生菌丝繁茂。在WA培养基上呈白色而且菌丝稀疏。小型分生孢子少见，大型分生孢子有两种形态:其一为纺锤型，两端均为楔形，多为3～5隔。其二为镰刀型顶端楔形，基胞有明显足跟，多为5隔。产孢细胞有两种，分别是多芽生和复瓶梗，厚垣孢子球型，多串生，间或顶生。

2.3.3 单隔镰刀菌（F.dimerum Penzig in Saccardo） 在PSA培养基上生长速率为3.05 cm,PSA基物背面观察为杏黄色，气生菌丝繁茂，致密，絮状。大型分生孢子短，中等偏窄，两端稍尖，顶胞弯曲，单个隔膜，形态一致，在培养基与康乃馨叶片上产生橘红色的分生孢子座，厚垣孢子在菌丝间单个间生或串生，表面光滑。

2.4 致病性测定

2.4.1 盆栽法致病性测定结果 盆栽法试验结果表明，接种的3种镰刀菌都能致病，且引起的症状相似。具体表现为植株感病后，首先从根尖开始变色，进而主根下半部出现褐色条斑，病斑多不凹陷，以后逐渐扩大，表皮及皮层变黑坏死，叶片由下而上逐渐变黄，植株矮化，但病程进展比较缓慢，严重时可造成整株死亡（表2）。

2.4.2 平皿法致病性测定结果 平皿测定结果见表3。接菌的种子在发芽9 d后陆续发病，幼苗初生根尖部开始出现坏死斑点症状，随时间的推移，胚根上出现变软及腐烂症状，直至萌发种子幼苗胚根腐烂，最终死亡。

由表3可知，不同菌种致病性强弱不同，在3种镰刀菌不同菌株间致病性强弱也有显著差异。其中，茄镰刀菌1～18号，半裸镰刀菌1～4号，单隔镰刀菌1、2号为强致病性菌株；半裸镰刀菌5～8号、10号，单隔镰刀菌3～5号、7号为中等强度致病性菌株；半裸镰刀菌9号，单隔镰刀菌6号，为弱致病性菌株。

表2 镰刀菌不同菌株致病性盆栽测定结果

表3 病原菌镰刀菌致病性平皿法测定结果

3 讨论

蚕豆镰刀菌根部病害（Fusarium spp.）是一个世界性的病害，关于蚕豆镰刀菌根腐病的病原，世界上不同蚕豆栽培地区的报道不尽相同。世界上最早报道蚕豆镰刀菌根腐病的是德国人Kirchmer，该病的病原是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，1890）[10]；随后Pape报道了蚕豆镰刀菌基腐病，该病的病原是燕麦镰刀菌 （F.avenaceum，1920）[10]；Miyake报道了蚕豆镰刀菌枯萎病，该病的病原是禾谷镰刀菌（F.graminearum，1924）[10]。从此，世界许多植物病理学家相继报道了对蚕豆镰刀菌根病病原的研究成果[4-20]。我国俞大绂对云南冬蚕豆镰刀菌根部病害进行了系统研究，通过症状表现，把蚕豆镰刀菌根病分为3种类型，即蚕豆镰刀菌枯萎病，病原是燕麦镰刀菌蚕豆变种和尖孢镰刀菌蚕豆变种（F.avenaceum var.fabae；F.oxysporium var.fabae）[10-11]；蚕豆镰刀菌根腐病，病原是茄镰刀菌和串珠镰刀菌（F.solani；F.moniliforme）[12-13,15]；蚕豆镰刀菌基腐病，病原是燕麦镰刀菌和禾谷镰刀菌（F.avenaceum；F.graminearum）[13-15]。这些研究成果为我国蚕豆镰刀菌根病的研究奠定了良好的基础。其后，阮兴业等研究报道了蚕豆苗期镰刀菌基腐病，病原有尖孢镰刀菌（F.oxysporium）、燕麦镰刀菌（F.avenaceum）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）、禾谷镰刀菌（F.graminearum）和木贼镰刀菌（F.equiseti）；镰刀菌基腐萎蔫病，病原是燕麦镰刀菌蚕豆变种（F.avenaceum var.fabae）；镰刀菌根腐病，病原是茄镰刀菌（F.solani）和拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）[17-19]。鲍建荣等报道了浙江省蚕豆镰刀菌病害的病原主要有锐顶镰刀菌（F.acuminatum）、尖孢镰刀菌（F.oxysporium）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）、三线镰刀菌（F.tricinctum）、串珠镰刀菌胶孢变种（F.var.subglutinans）和茄镰刀菌（F.solani）[16]。任海英等研究报道了江苏常熟地区蚕豆枯萎病的病原主要是尖孢镰刀菌（F.oxysporium）、燕麦镰刀菌（F.avenaceum）、木贼镰刀菌（F.equiseti）和串珠镰刀菌（F.moniliforme）[7]。王晓鸣等鉴定青海省春蚕豆镰刀菌根腐病病原为茄镰刀菌（F.solani）；蚕豆镰刀菌枯萎病的病原为尖孢镰刀菌（F.oxysporium）[18]。李春杰等研究报道甘肃临夏地区春蚕豆镰刀菌根腐病的病原为茄镰刀菌（F.solani）、尖孢镰刀菌（F.oxysporium）和燕麦镰刀菌（F.avenaceum）[2]。

本文报道的蚕豆镰刀菌根腐病的病原茄镰刀菌与之前的报道是一致的[2,12－13,15,17-18]；而病原半裸镰刀菌和病原单隔镰刀菌属首次报道。单隔镰刀菌对植物的致病性研究报道较少，有待进一步研究。另外，茄镰刀菌虽然可以引起多种植物根腐病，但存在几十种致病专化型，本文报道的病原茄镰刀菌对其他植物的致病性还有待进一步研究。有文献报道，蚕豆根腐病存在病原镰刀菌与其他病原真菌复合侵染的情况[8,11,13]，关于这一问题，尚有待深入细致的研究。

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