紫苏组织培养与快速繁殖

史华平，王计平

（1.山西省农业科学院 果树研究所，山西 太谷 030815;2.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

紫苏组织培养与快速繁殖

史华平1，王计平2

（1.山西省农业科学院 果树研究所，山西 太谷 030815;2.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

以栽培紫苏为材料，通过对其离体茎段的组织培养，建立了诱导、分化、增殖、生根等一整套离体快繁体系。研究结果表明，紫苏茎段外植体较好的灭菌方法为：75%酒精30s＋0.1%HgCl210min;茎段外植体初代培养的适宜培养基为 MS＋2mg·L－16-BA＋0.5mg·L－1NAA;继代及增殖培养以6-BA 2mg·L－1与NAA0.1mg·L－1配比时效果较好;试管苗生根培养的最适宜培养基是1／2MS基本培养基附加0.2mg·L－1NAA。

紫苏;组织培养;快速繁殖;茎段

紫苏［Perillafrutescens（L.)Britton var.crispa（Thbg.)Hand.-Mazz］为唇形科紫苏属一年生草本植物，又称为桂荏、赤苏、白苏、回回苏、香苏等。［1］紫苏在我国已有2000多年的栽培历史，主要用作药用和蔬菜。现代医学证实，紫苏挥发油能对肿瘤坏死因子产生影响，可以增强人体免疫功能，延缓肌体衰老，抑制老鼠癌细胞增殖。［2，3］

随着组织培养技术的不断发展，我国科技工作者利用植物组织或细胞的大量培养直接生产药物的研究也取得了很大进展，［4］唇形科植物在组培养方面取得了一定的成果，猫须草、［5］丹参、［6］黄芩、［7］广藿香、［8］鞘蕊花、［9］丁香罗勒、［10］红根草［11］等组织培养已获得再生植株。目前有关紫苏组织培养及快繁技术的报道很少，［12，13］而且并没有通过茎段培养获得再生植株的详细报道。如能建立起一套完善的紫苏离体快繁体系，将为紫苏这一优良物种扩繁以及深入研究提供一定理论基础。

本文以山西省栽培紫苏为材料，通过对其茎段的组织培养，建立了诱导、分化、增殖、生根等一整套离体快繁体系。这对紫苏种质的保存，抗逆新品种的培育、推广及规模化生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

栽培紫苏，由山西农业大学农学院崔福柱老师提供，取其幼嫩茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体材料的处理与消毒

5月中下旬当株高约20cm时剪取紫苏茎段，用自来水冲洗10min，洗净泥土，然后采用不同的灭菌方法进行灭菌处理。

（1)75%的酒精消毒30s，0.1%的升汞消毒3 min，无菌水冲洗5～6次。

（2)75%的酒精消毒30s，0.1%的升汞消毒5 min，无菌水冲洗5～6次。

（3)75%的酒精消毒30s，0.1%的升汞消毒7 min，无菌水冲洗5～6次。

（4)75%的酒精消毒30s，0.1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗5～6次。

（5)75%的酒精消毒30s，0.1%的升汞消毒15min，无菌水冲洗5～6次。

1.2.2 茎段外植体初代培养

将细嫩茎尖和带1～2个腋芽的茎段接种到含有不同配比生长调节物质的MS初代培养基上，进行离体培养，诱导丛芽的分化。每个三角瓶接3株，每种培养基接种30株。

1.2.3 继代及增殖培养

当初代培养的无菌苗长至3～4cm时剪取带芽茎段接入增殖培养基中，以MS为基本培养基，附加不同浓度6-BA。NAA浓度均为0.1mg·L－1，3.0%蔗糖和0.6%琼脂，pH 5.8。2周后调查苗的生长情况，观察同种激素的不同浓度及不同激素的各种配比对其器官分化的影响，并从中筛选出适合紫苏快繁的最适培养基。

1.2.4 生根培养

以单株未生根幼苗为材料，分别接种于不同生根培养基上，每种培养基接种30株，每个三角瓶接3株。1个月后调查不同培养基上的生根率、生根质量、苗高等。

1.2.5 培养条件及结果统计方法

在上述诱导、增殖和生根培养中，如无特别说明，培养条件均为培养温度 （25±1)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为16h·d－1，空气相对湿度70%～80% 。

污染率（%)＝（污染外植体数／接种外植体总数)×100%

死亡率（%)＝（死亡个数／接种外植体总数)×100%;（外植体不萌动，出现芽体变黑视为外植体死亡)

存活率（%)＝（未污染且萌动个数／接种外植体总数)×100%

芽分化频率（%)＝（再生芽外植体数／接种外植体总数)×100%

生根率（%)＝（生根植株数／接种株数)×100%

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对茎段外植体消毒效果的影响

本研究分别设置了5个处理时间进行消毒，茎段外植体经75%的酒精消毒30s后，用0.1%升汞消毒处理，结果见表1。由表1可知，随着处理时间的延长，外植体污染率逐渐降低，死亡率逐渐升高，说明较长时间HgCl2处理会对外植体材料造成一定伤害;5个不同处理时间中，0.1%HgCl2处理3min外植体的死亡率虽然是0，但外植体的污染率却达到56.2%，存活率也只有43.8%;而0.1%HgCl2处理7～15min，虽然外植体有一定的污染，但死亡率较低，其存活率在80%以上，方差分析结果表明，处理4即0.1%HgCl2消毒10 min，外植体存活率高达90.3%，消毒效果最好，是较适宜的外植体处理时间。因此，综合其发芽率、污染率及生长态势，紫苏茎段外植体较好的灭菌方法为：75%酒精30s＋0.1%HgCl210min。

2.2 不同激素配比对紫苏茎段外植体初代培养的影响

在添加不同生长调节物质的MS培养基中，外源激素的种类和浓度是影响植物芽诱导分化的关键因子。一般来讲，只有适宜的生长素与细胞分裂素浓度配比，才能诱导植物离体再生，并且提高再生效率。本试验将通过灭菌处理的紫苏茎段外植体接种于基本培养基（0.6%琼脂，3%蔗糖，pH值调至5.8)附加不同浓度生长素NAA和细胞分裂素6-BA的诱导培养基上，生长点朝上，伤口紧贴培养基表面，诱导芽分化。

从表2可以看出，培养基所含激素种类及剂量对诱导芽分化的时间和频率有明显的影响。在单独附加6-BA的MS基本培养基上，诱导芽分化的时间比较长，可以达50d以上，分化频率也较低;在添加相同浓度6-BA条件下，加入NAA更有利于紫苏丛生芽的形成，以 MS培养基添加2.0 mg·L－16-BA与0.5mg·L－1NAA诱导效果最好，能诱导大量丛生芽产生，而且芽略显粗壮，色绿，所以 MS＋2.0mg·L－16-BA＋0.5mg·L－1NAA是紫苏诱导芽分化的适宜培养基。

表1 处理时间对外植体材料消毒效果的影响Table 1 Effects of treatment time on the disinfection of Perillafrutescens stems

表2 不同激素配比对诱导芽分化的影响Table 2 Effect of different combination of hormone on adventitious buds induction of Perillafrutescens

2.3 不同浓度6-BA对紫苏茎段继代培养和芽增殖效果的影响

将紫苏芽体转入继代培养基培养可促使丛生芽进一步增殖，筛选合适的继代培养基及培养条件，更有利于芽的分化和增殖。以接种30d后的芽苗株数计算增殖速率，测定不同浓度的6-BA对增殖速率的影响。

试验结果发现（表3)，培养基中附加了不同浓度6-BA和0.1mg·L－1NAA的各种配比时均可诱导腋芽分化，但芽的分化数量及生长状况差异很大。当6-BA浓度过高时，就会产生过于细密的丛芽，芽虽然多且增殖速度快，但苗较为细弱;而当6-BA浓度过低时，则会影响芽的增殖速度，达不到大量繁殖的目的。因此，在试管苗增殖培养过程中需要特别注意6-BA与NAA的浓度配比，本研究中以6-BA 3.0mg·L－1与 NAA0.1mg·L－1配比时效果较好，芽增殖率较高，且芽生长健壮，培养60d后，平均苗高可达5cm左右。

表3 不同浓度的6-BA对紫苏不定芽增殖效果的影响Table 3 Effect of concentration of 6-BA on bud differentiation and proliferation of Perillafrutescens

2.4 试管苗生根培养

将30株试管苗接种于添加了不同浓度NAA与IBA的1／2MS培养基中，进行生根培养。发现NAA对于紫苏试管苗生根效果高于IBA，生根率达90%以上，但接种在1／2MS附加0.2mg·L－1NAA培养基上平均根数最高，为7.42个，所以该培养基是紫苏试管苗生根培养的最适宜培养基（见表4)。

表4 不同生长素浓度对试管苗生根的影响Table 4 Effect of concentration of auxins on rooting of Perillafrutescens

3 结论与讨论

（1)紫苏是一种经济价值很高的多用途植物，靠种子进行繁殖，种性易退化，从而限制了生产的发展，利用组织培养技术，可以获得大量再生植株。但紫苏全株密被长绒毛，用其茎叶作外植体，很难彻底消毒，用其幼嫩叶片作外植体诱导愈伤培养，也能诱导出苗，但污染率非常高。研究结果表明，HgCl2消毒时间越长污染率越低，但是死亡率也高，综合其发芽率、污染率及生长状态，紫苏茎段外植体较好的灭菌方法为：75%酒精30s＋0.1%HgCl210min。

（2)在建立紫苏茎段再生体系的过程中，随着6-BA浓度的提高，芽分化率不断提高，但苗分化相对细弱;添加NAA0.5mg·L－1时，苗的生长量增加，苗较为茁壮。因此，只有在6-BA和NAA 2种激素浓度配比适宜的条件下，紫苏组培快繁才会获得较好的效果。研究表明，在 MS＋2.0mg·L－16-BA＋0.5mg·L－1NAA培养基上茎段外植体生长健壮，芽分化数和诱导率较高，该培养基为茎段初代培养的最适培养基。在继代培养中，6-BA对芽的分化起重要作用，其浓度大小会影响芽诱导分化及增殖速率。一般情况下，在一定的浓度范围内，较高浓度的6-BA有利于芽的形成和生长。研究表明，紫苏茎段最适宜继代培养基为MS＋3.0 mg·L－16-BA＋0.1mg·L－1NAA。离体试管苗在不同生长素作用下均有生根效果，但紫苏生根最适宜培养基为1／2MS＋0.2mg·L－1NAA。

［1］何东平.中国植物油料油脂加工科技发展探讨［J］.粮食科技与经济，2004（3)：35-37.

［2］王计平，史华平，李润植.紫苏种子脂肪酸组成及合成代谢研究进展［J］.生物技术通报，2011（4)：31-34.

［3］Teruszkin Balassiano L，Alves de Paulo S，et al.Effects of perillyl alcohol in glial C6cell line in vitro and anti-meta-static activity in chorioallantoic membrane model［J］.Inter-national Journal of Molecular Medicine，2002，10（6)：785-788.

［4］高文远，贾伟.药用植物大规模组织培养［M］.北京：化学工业出版社，2005：19-23.

［5］王连翠，张玉翠.猫须草的组织培养与植株再生［J］.中国农村小康科技，2005（12)：3.

［6］邝荔香，刘静.张艳，等.同源四倍体丹参组织培养中的污染及防治措施［J］.安徽医药，2009（5)：562-563.

［7］王丹.黄芩组织培养与快速繁殖研究［J］.现代化农业，2009（1)：18-20.

［8］肖省娥，贺红，徐鸿华.广藿香组织培养与植株再生研究［J］.中药材，2001，24（6)：627.

［9］罗桂芬.鞘蕊花的组织培养［J］.植物生理学通讯，1992，28（2)：11.

［10］程治英.毛叶丁香罗勒的快速繁殖［J］.植物生理学通讯，1988，24（6)：13.

［11］唐凤鸾，李锋，付传明，等.红根草的组织培养与快速繁殖研究［J］.广西植物，2006，26（3)：282-285.

［12］黄美娟，张蕾，黄海泉.紫苏的组织培养及快繁技术研究［J］.北方园艺，2008（1)：198-200.

［13］于淑玲，石晓云.紫苏组织培养体系的研究［J］.邢台学院学报，2008，23（2)：118-119.

Tissue Culture and Rapid Propagation ofPerillafrutescens

SHI Hua-ping1，WANG Ji-ping2
（1.InstituteofPomology，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，TaiguShanxi030815，China;2.Collegeof Agriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China)

In this paper，with the stems ofPerillafrutescensas explants，a set of propagation systeminvitroabout the tissue culture of induction，differentiation，proliferation，rooting was established.The results showed that the optimal sterilization method for stems ofPerillafrutescenswas 75%alcohol 30s＋0.1%HgCl210min;the optimal early culture medium was MS＋2mg·L－16-BA＋0.5mg·L－1NAA，on which the stem explants could grow vigorously，the bud differentiation amount and induction rate were higher;the optimal proliferation culture medium among all tested media was 2mg·L－16-BA＋0.1mg·L－1NAA;the optimal rooting culture medium among all tested ones was 1／2MS basic medium added 0.2mg·L－1NAA.

Perillafrutescens;Tissue culture;Rapid Propagation;Stems

S567.21＋9

A

1671-8151（2011)06-0498-04

2011-10-31

2011-11-09

史华平（1974-)，男（汉)，山西昔阳人，在职研究生，助研，主要从事植物生理与组织培养技术方面的研究。

王计平，副教授，硕士生导师。Tel：0354- 6285608;E-mail：sxndwjp＠163.com。

国家863项目（2006AA100204);山西农业大学博士科研启动基金（412568)

（编辑：武英耀)