芽孢杆菌 PAS38和β-甘露聚糖对家兔小肠生长抑素的影响研究

文│陈 岗（四川省自贡市动物疫病预防控制中心）沈 洁（四川省自贡市农业广播电视学校）

芽孢杆菌制剂是一种广泛应用于生产的微生态制剂，能抵抗各种不良环境，对热、pH值和盐具有广泛耐受性，特别是芽孢杆菌可产生淀粉酶、蛋白酶、β-寡糖酶、超氧化物歧化酶等，因此，芽孢杆菌制剂在畜牧业和发酵工业中发挥着重要作用。寡糖作为一种新型的寡糖添加剂，具有稳定性好、用量小及来源丰富等特点。目前，国内外对益生素和寡糖的研究主要集中在提高动物生产性能、改善肠道微生态环境方面，而对动物肠道黏膜的神经内分泌免疫网络影响没有系统报道。本试验旨在通过对家兔饲喂芽孢杆菌制剂和寡糖制剂，研究其肠道黏膜生长抑素（SS）在小肠黏膜中的分布及其数量变化，从而为研究微生态制剂和寡糖与动物肠道黏膜神经内分泌免疫的关系，提供进一步的试验依据。

一、材料与方法

1.材料。

（1）实验动物及基础日粮。48只40日龄断奶加利福尼亚兔，雄性，预试五天后，体重750±101克，购自四川省自贡市畜牧局种畜场。试验基础日粮：参照家兔的营养需要，基础日粮配方见表1。

表1 家兔基础日粮配方%

（2）芽孢杆菌制剂和低聚糖。芽孢杆菌PAS38制剂：由自贡市动物疫病预防控制中心实验室研制。β-寡糖制剂：购自湖北天琪生物工程有限公司，浓度＞99%。

2.方法。

（1）试验分组及管理。将48只40日龄加利福尼亚兔随机分为芽孢（0.1%蜡样芽孢杆菌）组（简称BG）、寡糖（0.15%β-寡糖）组（简称OG）、混合（0.1%蜡样芽孢杆菌＋0.15%β-寡糖）组（简称MG）、对照组（简称CG），每组12只，见表2。饲喂时间为50天，其中预试期5天，正式试验45天。早上8点和晚上6点各喂一次饲料。日粮每天按组分别称量饲喂，并将前次未采食完的日粮全部收集晒干称重。自由饮水，中午给予同样质量的青贮饲料。兔舍上下午各打扫一次，保持兔舍内空气新鲜，保持周围环境安静，做好记录。每日平均温度为（26±2）℃。

表2 试验家兔分组情况

（2）标本制备。所有实验动物于正式饲喂第15、30、45日早上8:00空腹称重后各组宰杀4只，采取空肠、十二指肠各一段，放入4%多聚甲醛中固定24小时，制成5微米厚的石蜡切片，用APES处理载玻片，用于生长抑素（SS）的免疫组化分析。

（3）免疫组织化学染色方法。石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2阻断内源性过氧化物的活性10分钟，微波修复抗原1～2次，正常山羊血清封闭非特异性背景20分钟，依次加入一抗（Mouse Anti-Rabbit Somatostatin，抗体浓度1∶200，4℃过夜），二抗（生物素标记的山羊抗兔，室温20分钟），SABC复合物室温20分钟，以上各步间均以PBS缓冲液（0.02摩尔/升，pH7.6）洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，观察，以细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性反应。用PBS代替一抗作为阴性对照。

（4）显微图像分析及结果处理。在显微镜下观察，拍照。每例动物随机选取5张切片，每张切片选取10个400倍视野计数，运用SPSS13.0统计软件进行方差分析，并用LSD法做显著性比较。

二、结果

SS阳性细胞主要分布在肠绒毛上皮之间，肠腺中分布较少。SS细胞中充满免疫反应阳性物质，尤以基底部及核周围明显，在细胞基底面及侧面细胞膜外可见免疫反应阳性物质溢出，但肠腔及腺腔内未见免疫反应阳性物质。十二指肠内SS免疫反应阳性细胞多呈圆形和椭圆形，多数细胞为开放型，可见细胞的突起伸向腺腔或肠腔面，见图1～2。

1.饲料中添加芽孢杆菌和β-寡糖对家兔十二指肠SS阳性细胞的影响。在阳性细胞密度方面，芽孢组十二指肠中SS阳性细胞数量比对照组显著减少（P＜0.05）；饲喂30天后，与对照组相比，芽孢组和寡糖组十二指肠中SS比对照组显著减少（P＜0.05），而混合组比对照组极显著减少（P＜0.01）；饲喂45天之后，各实验组十二指肠中SS阳性细胞数量已恢复正常水平，与对照组比较无显著差异（P＞0.05）结果见表3和图3。

图1 十二指肠SS阳性细胞，SABC×400

图2 空肠SS阳性细胞，SABC×400

表3 家兔小肠中SS阳性细胞密度变化（±s，个）

在平均灰度值方面，饲喂15天后，三个实验组十二指肠中SS阳性细胞平均灰度值与对照组相比无显著差异（P＞0.05）；饲喂30天后，与对照组相比，三个实验组十二指肠中SS平均灰度值比对照组显著升高（P＜0.05）；饲喂45天之后，各实验组十二指肠中SS阳性细胞平均灰度值已接近对照组水平，与对照组比较无显著差异（P＞0.05）。结果见表4和图4。

表4 家兔小肠中SS阳性细胞平均灰度变化（±s）

2.饲料中添加芽孢杆菌和β-寡糖对家兔空肠SS阳性细胞的影响。在阳性细胞密度方面，饲喂15天后，三个实验组空肠中SS阳性细胞数量均比对照组显著减少（P＜0.05）；饲喂30天后，与对照组相比，寡糖组空肠中SS阳性细胞数量显著减少（P＜0.05），芽孢组和混合组空肠中SS极显著减少（p＜0.01）；饲喂45天之后，芽孢组和寡糖组空肠中SS阳性细胞数量已经恢复正常水平，而混合组与对照组相比，仍有显著差异（p＜0.05）， 结果见表3和图5。

图3 各组家兔十二指肠SS阳性细胞数量变化的比较

图4 各组家兔十二指肠SS阳性细胞平均灰度值变化的比较

图5 各组家兔空肠SS阳性细胞数量变化的比较

图6 各组家兔空肠SS阳性细胞平均灰度值变化的比较

在平均灰度值方面，饲喂15天后，芽孢组和混合组空肠中SS阳性细胞平均灰度值均比对照组显著升高（P＜0.05）；饲喂30天后，与对照组相比，寡糖组空肠中SS阳性细胞平均灰度值显著升高（P＜0.05），芽孢组和混合组极显著升高（P＜0.01）；饲喂45天之后，芽孢组和寡糖组空肠中SS平均灰度值已经接近对照组水平，而混合组与对照组相比，仍有显著差异（P＜0.05）。结果见表4和图6。

三、讨论

生长抑素（Somatostatin，SS）阳性细胞分布很广泛，不仅存在于中枢神经系统，而且存在于所有动物的胃肠道中，是小肠中一种主要的神经内分泌细胞。SS对胃肠道消化吸收及其他内分泌细胞起普遍性的抑制作用，如抑制几乎所有胃肠激素如胃泌素、血管活性肠肽、胰泌素和胃动素等的分泌；抑制胃肠运动，因此对机体的消化吸收功能有重要影响。许多研究表明SS影响小肠的黏膜免疫反应，杨倩等实验发现随着SS水平的降低，小肠上皮内淋巴细胞（IEL）的数量有明显增多。SS还可以抑制T淋巴细胞的活动和淋巴细胞免疫球蛋白的合成，SIgA是黏膜免疫中最主要的效应因子，SIgA不仅能防止病原微生物在黏膜表面的黏附，还可以通过中和黏膜上皮内的病原体来捕获进入到黏膜内层的病原体，而SS对IgA合成的抑制作用可高达20%～50%。

本实验采用免疫组织化学方法，用二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂对SS阳性细胞进行了标记，与Porter报道结果基本一致，SS阳性细胞主要分布在肠绒毛上皮之间，细胞多为圆形和椭圆形，有突起，属开放型分泌。实验结果显示，芽孢杆菌和寡糖均能够使家兔小肠中SS阳性细胞密度降低，降低了SS对其他内分泌细胞和胃肠激素的抑制作用，从而增强了胃肠道的消化吸收功能。在小肠固有层中存在大量的免疫细胞，如IgA阳性细胞、肥大细胞及T淋巴细胞等，研究发现，这些免疫细胞上存在SS受体，小肠中SS阳性细胞数量的减少也可使这些免疫细胞的数量增加，从而提高小肠的局部免疫功能。从饲喂的各个时期来看，芽孢组小肠中SS阳性细胞的平均数量均低于寡糖组，说明了两者单独使用时，芽孢杆菌对内分泌免疫的调节作用要优于寡糖。两者联合使用之后，小肠中SS阳性细胞的数量进一步减少，这可能是因为寡糖可以作为益生菌的增殖剂，促进了芽孢杆菌在肠道中增殖，从而使两者表现出一定的协同效应。