新疆卡拉库尔羊Fas基因的克隆及核苷酸序列分析

潘 辉 贺艳艳 李莲瑞

Fas又称APO－1，或者称CD95分子，它属于神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体超家族成员［1］，是一种细胞凋亡信号受体，因此亦被成为死亡分子。Fas诱导的细胞凋亡途径又被称为细胞凋亡的外部途径，目前发现的死亡受体可以分为三大类，Fas是其中一种死亡受体的代表［2］。

细胞凋亡是指细胞程序化死亡，它与免疫有着重要的关系。有病毒能够通过诱导T细胞自身发生凋亡，从而达到免疫抑制的目的［3］。目前已发现细胞凋亡与多种免疫缺陷病及细胞增生性疾病有关［4］，但是不同信号通路引起的细胞凋亡所引起的疾病亦有所不同，这也极大程度的激发了研究者对细胞凋亡致病机理研究的热情。

Fas通过与其配体的结合以达到引起细胞凋亡的目的，可以说Fas是细胞凋亡的正控元件。FasL主要在活化的T淋巴细胞表面表达，Fas与之结合诱导细胞凋亡是T细胞杀伤靶细胞的主要途径之一［5］。

中国卡拉库尔羊属于脂尾粗毛羊，其羔皮具有美丽的毛卷，在国际市场享有盛誉，具有良好的经济价值。同时，卡拉库尔羊耐严寒、酷暑和干旱的大陆性气候，非常适合在新疆地区养殖［6］。近几年，高密度集约化的养殖模式引起一些严重的卡拉库尔羊传染病相继出现，对畜牧业提出了严峻的挑战。

利用同源克隆技术，扩增出卡拉库尔羊Fas基因，通过核苷酸分析和序列比对可以从分子水平来了解卡拉库尔羊Fas的特异性变化，为研究者从分子免疫学角度研究卡拉库尔羊抗病力提供了理论基础。克隆卡拉库尔羊Fas基因为制备相应的核酸探针打下基础，Fas探针的制备能够为卡拉库尔羊某些疾病的诊断作出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、菌株、质粒

卡拉库尔羊由塔里木大学动物科学学院试验站提供;菌株E.coli DH5α本实验室储存、质粒pMD18－T购自上海生工生物工程技术有限公司。

1.1.2 试剂及酶

人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;Trizol购于invitrogen公司;Taq酶、T4 DNA连接酶、dNTP、逆转录试剂盒 PrimeScript Revere Transcriptase购自TaKaRa公司;限制性内切酶购自大连宝生物工程公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自爱思进生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根据GeneBank中绵羊的Fas基因序列全长为976 bp(NM_001123003)设计卡拉库尔羊Fas基因的一对引物PF、PR，由上海生工生物工程技术有限公司合成。为便于基因的克隆，在引物中引入了Eco R I和Xho I的酶切位点(以下划线表示)。

1.2.2 卡拉库尔羊淋巴细胞的提取

采集健康的卡拉库尔羊血液10 mL，添加1 mL 3.8%枸橼酸钠溶液抗凝，然后将新鲜抗凝血11 mL.与Hank＇s液1:1稀释混匀后，以2 mL/管的量分别置于玻璃离心管中，用移液枪吸取稀释血液2 mL，沿管壁缓缓的叠加到1 mL人淋巴细胞分离液界面上，注意不要破坏分离液界面，以2000 r/min离心35 min后吸取淋巴细胞层［7］。

1.2.3 卡拉库尔羊Fas基因的克隆

卡拉库尔羊淋巴细胞总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行。第一链cDNA的合成也按照PrimeScript Revere Transcriptase说明书进行。然后以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。在20μL的PCR体系中:10×one step RT－PCR buffer 2μL，dNTP 1.6 μL，引物 PF、PR 各0.5 μL，模板 cDNA 1 μL，Taq 酶 0.4 μL，ddH2O 14 μL。PCR 程序设定:95℃预变性5 min，1个周期;94℃变性30 s;60.9℃ 退火30 s，72℃延伸1 min20 s，循环35个周期;最后72℃延伸10 min。取10μL PCR产物电泳检测。用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物中的目的片段(操作见试剂盒说明书)，参照克隆载体pMD18－T说明书，构重组质粒 pMD18－T－Fas。将此重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选和菌落PCR法初步鉴定后，再经过双酶切鉴定，将可能的阳性克隆子送到上海生工生物工程技术有限公司测序，用DNA软件分析测序结果。

2 结果

2.1 Fas基因扩增

从淋巴细胞中提取总RNA，进行RT－PCR扩

2.2 重组质粒的鉴定

为了验证所得的阳性重组质粒，将提取的pMD18T－Fas重组质粒进行PCR及双酶切鉴定。PCR结果出现大小约为994 bp片段(图2)。由于在双酶切时会切除保护性碱基形成黏性末端，结果pMD18T－Fas重组质粒经Eco R I和Xho I双酶切后得到一个约为986 bp的片段(图3)，上述获得的片段大小均与预计相符。增，得到994 bp Fas目的基因(图1)。

2.3 测序结果及分析比较

含有重组Fas基因的质粒经华大中生科技有限公司测序，证实本实验中扩增的Fas基因为994 bp，含有一个750 bp的开放阅读框，编码了250个氨基酸，其中亲水性氨基酸占36.8%，疏水性氨基酸占31.2%，碱性氨基酸占 18.4%，酸性氨基酸占13.6%，推断的蛋白理论分子量为39.7 KDa。经过BLAST比对发现，扩增的Fas基因为半长基因，未包含信号肽序列。7－49位、51－87位均为胞外区富含半胱氨酸的结构亚域，它是Fas与Fas L相互作用的部位，95－117的18个氨基酸构成了氨基酸的跨膜区;胞质区则包含了一个由95个氨基酸构成的死亡结构域(图4)。

图4 扩增序列包含的一个大小为750 bp的开放阅读框，对其结构域进行分析，它包含完整的Fas基因胞外区(TNFR)，跨膜区，和胞质区(死亡结构域)。

物种间Fas基因的比较分析，将卡拉库尔羊的Fas基因与其它物种的相对应区域进行比对，发现卡拉库尔羊Fas基因的核苷酸序列与参考序列NM_001123003同源性高达99.69%，与牛、猪、人的核苷酸序列同源性分别为 94.93%、75.52%、69.83%，其氨基酸同源性分别为 91.13%、69.11%、59.20%。

将各物种Fas的氨基酸序列比对后，构建系统进化树(图5)，由图可以看出Fas蛋白与同是反刍类的羊和牛同源性最近，与啮齿类动物的小鼠同源性较远。

3 讨论

3.1 经过BLAST比对发现，扩增的Fas基因为半长基因，未包含信号肽序列。7－49位、51－87位均为胞外区富含半胱氨酸的结构亚域，它是Fas与Fas L相互作用的部位，Fas及FasL是导致细胞凋亡的关键分子，是细胞免疫应答的重要介质，其涉及到自身免疫、验证组织损伤等病理损伤［8］。95－117的18个氨基酸构成了氨基酸的跨膜区;胞质区则包含了一个由95个氨基酸构成的死亡结构域。Fas的死亡结构域在Fas与Fas结合后形成三聚体的活化形式，随后引起与之结合的Fas相关死亡受体蛋白(FADD)的构想发生变化，从而启动白介素1β转化酶(ICE)的级联反应，最终导致凋亡［9－10］。

3.2 将各物种Fas的氨基酸序列比对后，构建系统进化树(图5)，由图可以看出Fas蛋白，同反刍类的羊和牛同源性最近，与啮齿类动物的小鼠同源性较远。

图5 使用MEGA 4.0的Neighbor－joining算法构建进化树

3.3 目前许多传染病在影响着养羊业的健康发展，通过研究宿主细胞对外来病原微生物的反应机制，探讨防治传染病的新途径，有助于提高养羊业的经济效益［11］。因此，采用RT－PCR技术克隆了卡拉库尔羊Fas基因，为进一步制备探针来检测Fas基因在卡拉库尔羊的细胞中的表达动态，对了解病毒与细胞凋亡的关系，为新的抗病毒策略提供思路。

［1］ 赵艳.死亡分子 Fas/CD95与细胞凋亡［J］.癌变·畸变· 突变，2001，3(1):55 －57.

［2］ Fiona L.Boguslaw S，Cristina P，et al.The Fas-FADD death domain complex structure unravels signalling by receptor clustering［J］.Nature，2009;457(7232):1019－22.

［3］ Hamel W Mangnelli L，Chiarugi VP，et al.Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase/Ganciclovir－mediated Apoptotic Death of Bystander Cells［J］.Cancer Res ，1996 ，56(12):2697 －2702.

［4］ 龙塔，杨自军，董发明.动物细胞凋亡与疾病的发生［J］.河南科技大学学报，2003，23(3):38 －41.

［5］ 郭梁，吴荣聪，王钊.与CD95相关的细胞凋亡和免疫调节［J］.生命的化学，2002，22(2):106－09.

［6］ 李莲瑞，陈根元，王晓斌.新疆卡拉库尔羊的研究现状及前景［J］.中国草食动物，2008，28(2):63－64.

［7］ 贺艳艳 ，潘辉 ，刘书东等.新疆多浪羊淋巴细胞分离和培养［J］.塔里木大学学报，2010，22(4):11 －14.

［8］ 唐恩洁，杨宗琪，赵明才.用人肝细胞cDNA文库制备Dig－Fas探针［J］.川北医学院学报，2000，15(3):1－3

［9］ 严玉霖，高洪，翁银标.Fas在内毒素致大鼠肝细胞凋亡中的作用［J］.中国兽医科学，2010，40(01):75－78.

［10］ Imtiyaz.H Z，Rosenberg SThe Fas－Associated Death Domain Protein Is Required in Apoptosis and TLR－Induced Proliferative Responses in B Cells.［J］Expand The Journal of Immunology，2006，176:6852－6861

［11］ 李军，李晓宁，杨坚.猪F a s基因的克隆及序列分析［J］.广 西 农 业 生 物 科 学，2006，5(1):6 －9.