反义ATM在体外对喉鳞状细胞癌ATM蛋白表达影响的研究*

江继平，冯 俊，唐嗣泉，刘世喜

(1.四川省公安厅，四川 成都 610041;2.川北医学院附属医院耳鼻喉科，四川 南充 637007;3.四川大学华西医院耳鼻喉咽－头颈外科，四川 成都 610041)

喉癌是头颈部原发于上皮的常见恶性肿瘤之一，目前主要治疗还是以手术和放射治疗为主，放疗可以充分保护喉的发声功能。ATM是与放射敏感性有关的基因，ATM蛋白表达水平差异与细胞放射敏感性程度之间存在一定的关系［1］。本研究中，我们使用反义多核苷酸作用于ATM以研究ATM蛋白表达。

1 材料和方法

1.1 细胞系

人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)由四川大学华西医院上呼吸道实验研究中心惠赠。

1.2 试 剂

Lipofectamine 2000、Opti-MEM I、Trizol kit购自美国Carlsbad公司;GAPDH单克隆抗体、SYBR Ex-Script RT-PCR Kit、SYBR Green Master Mix 试剂盒购自Takara公司;ATM单克隆抗体、BCIP/NBT购自美国Santa Cruz公司。

1.3 目标序列的选择及多核苷酸的合成

于NCBIGenBank查出人ATM序列，设计反义ATM核苷酸(AS:5’-GTACTAGACTCATGGTTCACAATTT-3’);正义ATM 核苷酸(Sen:5’-AAATTGTGAACCATGAGTCTAGTAC-3’);错配 ATM 核苷酸 (Mis:5’-AAAATGTAAACCATAAGTCTAGAAC-3’)。送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 多核苷酸转染喉鳞状细胞癌细胞

将生长良好的Hep-2约2×105，置于6孔板中培养，待其生长到70－80%时备用。取0.8ug的反义ATM核苷酸、正义ATM核苷酸、错配ATM核苷酸及Lipofectamine 2000分别加入到Opti-MEM I中，在常温下作用5分钟。而后将核苷酸与Lipofectamine 2000在常温下作用20分钟后加入Hep-2细胞中，在37℃，5%CO2孵箱中作用。6小时后用PBS洗两次。最后用 RPMI－1640取代 PBS，在37℃孵箱中过夜备用。

1.5 Western blot分析

收集1.4所述的细胞1×107，以冷 PBS清洗3次，以裂解缓冲液制备细胞总蛋白，总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，然后转膜(硝酸纤维素膜 )，用5%的脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜上的蛋白潜在结合位点，加入ATM单克隆抗体(1:100)4℃过夜，GAPDH作为阳性对照，加入二抗后BCIP/NBT试剂显色、照相。

1.6 统计学处理

采用SPSS 18.0软件分析。数据以均数±标准差表示，变量资料之间的比较采用秩和检验。

2 结 果

将多核苷酸AS、Sen、Mis转染喉鳞状细胞癌细胞后，进行Western blot分析，从图1可以看出AS组蛋白表达明显较 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂质体)组蛋白表达低，从图2(各组蛋白表达的灰度扫描)可以更准确的得出 AS、Sen、Mis、lipo与 hep-2组(对照组)的蛋白相对表达量以AS-lipo组最低，为48.14±5.53%，用SPSS 18.0软件分析各组蛋白表达灰度可以得出，AS组与 Sen、Mis、lipo、hep-2 组比较有统计学意义。Sen、Mis、lipo、hep-2组之间比较无统计学意义。

3 讨论

喉癌是头颈部原发于上皮的常见恶性肿瘤之一，其发病率逐渐上升。虽然其诊断和治疗手段在过去的30多年已有飞速发展，但其5年生存率却没有显著提高，目前主要治疗还是以手术和放射治疗为主［2，3］。放疗可以充分保护喉作为发声器官的重要生理功能、减少手术范围和创伤，有其特有的优越性。然而由于喉鳞癌细胞对射线的抗拒能力，导致放射敏感性降低，影响了治疗效果［4］。

许多因素决定着细胞对放射线的反应，其中细胞的DNA损伤修复能力及细胞周期调控是细胞放射敏感性的主要决定因素［5］。而ATM基因在DSB损伤修复及细胞周期调控的信号传导中扮演着极其重要的作用，因此成为肿瘤放射增敏的一个重要靶基因［6］共济失调毛细血管扩张症(ataxia－telangiectasia，AT)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，以进行性中枢神经元变性免疫缺陷和对放射线敏感为特点，由于AT患者这种特殊的遗传性的辐射敏感性，使得其致病基因(ataxia－telangiectasia mutant，ATM)已成为放射生物学界研究辐射敏感性机制的重要对象之一。因此，我们用反义ATM作用于喉鳞状细胞癌细胞(Hep－2)后，对其ATM蛋白表达进行检测，探讨 ATM蛋白表达水平与喉癌细胞株间放射敏感性差异的关系，以期为进一步了解临床喉癌放射生物学特征提供实验依据。从Western blot分析，将多核苷酸AS转染喉鳞状细胞癌细胞，与转染Sen、Mis、lipo相比，其蛋白表达量最低，仅为对照组(hep-2组)的(48.14±5.53)%，故反义 ATM核苷酸(AS)能有效抑制喉鳞状细胞癌细胞中ATM蛋白的表达。已有研究表明，ATM蛋白表达水平差异与细胞放射敏感性程度之间存在一定的关系［1］。Zou Jian等［7］用脂质体将反义ATM导入头颈鳞癌细胞系SCCVII中，转染24小时后ATM蛋白表达量减少，与转入无关序列相比，转染反义ATM的SCCVII细胞在辐照后表现出内在放射敏感性增强。实验中我们用反义ATM使喉鳞状细胞癌细胞中ATM蛋白的表达降低，故我们推测其亦有可能使喉鳞状细胞癌细胞对放射治疗的敏感性增强，进而可能为喉癌的非手术治疗，保留喉的发声功能、提高喉癌病人的生存质量成为可能。

［1］LEI L，MICHAEL S，RANDY JL.Cellular responses to ionizing radiation damage ［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，(49):1157－1162

［2］Akman FC，Dag N，Ataman OU，et al.The impact of treatment center on the outcome of patients with laryngeal cancer treated with surgery and radiotherapy［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2008，265(10):1245－1255

［3］Smith RB.Surgery in the management of laryngeal and hypopharyngeal carcinoma［J］.International journal of radiation oncology，2007，69(2 Suppl):28－30

［4］Hristov B，Bajaj GK.Radiotherapeutic management of laryngeal carcinoma［J］.Otolaryngologic clinics of North America，2008，41(4):715－740

［5］Rodemann HP，Blaese MA.Responses of normal cells to ionizing radiation［J］.Seminars in radiation oncology ，2007，17(2):81 －88

［6］Choi EK，Ji IM，Lee SR，et al.Radiosensitization of tumor cells by modulation of ATM kinase［J］.International journal of radiation biology，2006，82(4):277－283

［7］Zou Jian，Qiao Xiaoming，Ye Huiping，et al.Antisense inhibition of ATM gene enhances the radiosensitivity of head and neck squamous cell carcinoma in mice［J］.Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2008，(27):56