3株产β－甘露聚糖酶菌株的分离和鉴定

赵仲麟，马 鑫，袁 超，李 燕，李淑英

(1.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002;2.中国农业科学院农业信息研究所，北京 100081;3.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;4.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450002;5.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

β－甘露聚糖酶是一类能够降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖的半纤维素水解酶，作为添加剂广泛应用于动物饲料中，同时在食品、药学、医学、造纸和纺织业中也具有重要的应用价值［1］.β－甘露聚糖酶主要来源于微生物，在细菌、真菌、放线菌中均有发现［2～4］.而工业高温环境中酶的热稳定性差一直是急需解决的问题，通过各种方法获得高酶活性和高耐受能力的β－甘露聚糖酶是解决这一问题的有效途径.中国的微生物资源丰富，通过建立共享酶源微生物资源库及遗传操作生物材料库，筛选获得具有新功能的酶蛋白，分离其编码基因，发掘新的生物催化剂基因资源及具有工业潜在应用价值的微生物菌株或功能基因是目前国家重点支持的研究方向.极端环境微生物具有极强的环境适应能力，其中蕴含大量独特的酶基因资源.本研究从新疆极端干燥环境采集的土样中，经筛选获得3株具有β－甘露聚糖酶活性的菌株，并对其进行的分子生物学的鉴定.以便为进一步寻找及开发有价值的产β－甘露聚糖酶的微生物奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验土样来源 试验土壤样品从新疆极端干燥环境中采集.

1.1.2 培养基 1)富集培养基的配制方法.称取魔芋精粉20 g，酵母膏5 g，蛋白胨3 g，NaCl 5 g，溶于1 L蒸馏水中，pH值为6.0，121℃ 高压蒸汽灭菌.2)固体分离培养基的配制方法.魔芋精粉10 g，NaNO33 g，MgSO4· 7H2O 5 g，KCl 5 g，K2HPO41 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 10 g，pH值为6.0，溶于1 L蒸馏水中，121℃ 高压蒸汽灭菌.3)发酵培养基的配制方法.分别称取魔芋精粉10 g，酵母膏5 g，蛋白胨3 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 5 g，KCl 5 g，K2HPO41 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，溶于1 L 蒸馏水中，pH 值为 6.0，121 ℃ 高压蒸汽灭菌后备用.

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的筛选 称取1 g土壤样品放入10 mL富集培养基中，37℃，160 r·min－1摇床培养6 d.将培养液离心后取上清液，用去离子水按不同比例梯度稀释，涂布于以魔芋精粉为碳源的固体分离培养基上，37℃恒温培养箱温育4 d.待长出菌落后反复划线分离，选取菌落小而水解圈大的单菌落进行后续试验.

1.2.2 菌株基因组的提取 挑取单菌落接入LB液体培养基中培养，取10 mL菌液用于基因组DNA的提取.使用Omega公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒提供的操作说明提取基因组DNA，DNA置于－20℃保存.

1.2.3 16S rRNA的PCR扩增与测序 设计细菌通用16S rRNA引物，正向引物F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和反向引物R1492:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，以基因组 DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增该菌株的16S rRNA基因，引物由北京擎科生物技术有限公司合成.PCR 反应体系(50 μL):模板 DNA 2 μL，正反向引物各 1 μL(20 μmol·L－1)，10 × buffer 5 μL，Ex Taq 酶(TaKaRa)0.5 μL，去离子水 40.5 μL.PCR参数为:94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30个循环，最后72℃补充延伸8 min，4℃ 保存.经质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶电泳后用DNA回收试剂盒(Omega)回收目的片段.16S rRNA扩增产物用pGEM-T载体(Promega)连接，转化 E.coli JM109后，由北京诺赛公司测序.

1.2.4 基于16S rRNA的系统发育分析 测序后序列使用DNAMAN软件进行序列拼接，提交到NCBI网站进行BLAST同源比对分析后，将所测得的16S rRNA基因序列与GeneBank中已知的相关菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比较，利用MEGA 4.0软件绘制系统发育树.

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

从新疆极端干燥的土壤中培养出含量丰富的细菌，涂布于含有魔芋精粉的固体培养基中，筛选出3株菌落小而水解圈相对较大的菌株(图1)，分别命名为 MX-1，MX-3，MX-10.

图1 在以魔芋精粉为碳源的固体培养基中的菌落形态Fig.1 Bacterial colonial morphology used konjaku flour as the only carbon source

本试验采用水解圈筛选法［5］，生长在含有葡甘露聚糖(魔芋精粉)的固体培养基上的细菌被诱导产生β－甘露聚糖酶，从而分解菌落周围的甘露聚糖形成透明圈.根据单菌落水解圈相对大小，则可初步判断菌株产β－甘露聚糖酶情况.由图1可知，培养后的3株菌有较强的水解甘露聚糖的能力.其中MX-10水解圈最大，同时圈内部形成许多细小的白色点状结构，另外2株菌没有发现该现象.

2.2 菌株16S rRNA片段的PCR扩增

以预先提取的基因组DNA为模板，扩增出的16S rRNA基因片段，大小约为1.5 kb，与预期大小相符(图2).

图2 菌株16S rRNA PCR产物Fig.2 PCR product of 16S rRNA of three strains

3株菌的16S rRNA基因的PCR产物测序后，分别在NCBI数据库中进行BLAST比对.将相似序列下载，并选取一些模式菌株，用MEGA软件和Neighbor-joining法构建菌株的系统发育树(图3).由图3可知，菌株 MX-1与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)位于同一分支，同源性达99%，推断MX-1为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii);MX-3与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)位于同一分支，同源性达99%，推断其很可能为多粘类芽孢杆菌.而MX-10则与芽孢杆菌Bacillus subtilis，Bacillus amyloliquefaciens和 Bacillus tequilensis 3株菌位于同一分支，同源性达99%，鉴定该菌属于芽孢杆菌属.

图3 16S rRNA序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences

3 结语

本研究从新疆极端环境土壤中筛选到了3株具有β－甘露聚糖酶活性的菌株.其中MX-3菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa).多粘类芽孢杆菌是一种生防菌，对植物黄萎病、油菜腐烂病等多种植物病害均具有一定的抑制作用.对人或动植物无致病性，某些菌株可产生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶等多种生物活性物质.这些活性物质在植物病害防治以及人和动物疾病治疗方面具有诱人的应用前景［6］.美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一［7］.而本研究分离得到的多粘类芽孢杆菌展示出了良好的β－甘露聚糖酶活性.本研究分离到的菌株MX-1鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，同样展示出较好的β－甘露聚糖酶活性，可作为克隆β－甘露聚糖酶基因的候补菌株.MX-10的16S rRNA比对结果表明，该菌与Bacillus subtilis等芽孢杆菌属细菌同源性达99%.作者已从MX-10菌株中克隆得到β－甘露聚糖酶基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达，得到的β－甘露聚糖酶具有较高的酶活性和热稳定性［8］.β－甘露聚糖酶基因的克隆和酶蛋白表达一直是饲料研究中的热点，研究人员都在寻找具有良好特性、可应用于工业生产的植酸酶［9～12］.随着研究的不断深入，β－甘露聚糖酶新基因的发现将会给环保型饲料添加剂产业的发展带来新的机遇.

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