尿素对羊瘤胃液MCP和原虫数的影响

张苏江 李成阳

(1 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300)

(2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300)

微生物蛋白(MCP)是反刍动物重要的蛋白质营养来源之一，可满足动物蛋白质营养需要量的40～80%[1]。研究表明，氨态氮是合成微生物蛋白质的原料，进入羊瘤胃内的尿素在微生物的作用下可降解为氨态氮，进一步被瘤胃微生物合成氨基酸和有机酸而被利用[2]。MCP代谢是瘤胃微生物区系营养代谢的一个重要的组成部分[3]。

尿素等非蛋白氮类饲料在反刍动物的养殖生产中已经被广泛应用，科学合理地利用尿素等非蛋白氮饲料是解决蛋白质饲料来源不足的重要手段之一。适量利用非蛋白氮饲料可以促进反刍动物的生产性能，过量的饲喂非蛋白氮饲料往往会引起动物的中毒。然而，尿素饲喂量对瘤胃MCP含量和原虫数量的影响鲜见报道。本研究以常用的非蛋白氮饲料尿素为材料，通过羊瘤胃液体外发酵的方法，探讨尿素水平对瘤胃发酵液MCP含量和原虫数量的影响，以期为尿素饲料的安全使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

尿素的浓度设置为6组，分别占底物基础饲料的0%、1%、2%、3%、4%和5%，每个浓度设3个重复样。使用100 ml玻璃注射器作为发酵管，每个发酵管中装取人工瘤胃液20 ml，底物2 g。体外发酵使用水浴摇床进行体外发酵，基础饲料组成见表1。

表1 基础饲料组成

1.2 仪器设备与瘤胃液

仪器设备:精料配合饲料、发酵管、水浴摇床、消化炉、消化管、全自动凯氏定氮仪、显微照相仪、血细胞计数板、保温杯等。

瘤胃液:瘤胃液采自体重30kg左右、安装有永久瘤胃瘘管的卡拉库尔羊。实验于2010年11月至2011年1月在塔里木大学生物研发中心进行。

1.2.1 人工瘤胃液配制

1.2.1.1 微量元素液A:称取氯化钙13.2 g、氯化锰10.0 g、氯化钴1.0 g、氯化铁8.0 g，加入到200 ml的烧杯中，加蒸馏水搅拌，待完全溶解后，转移到1 000 ml的容量瓶中，加蒸馏水定容到1 000 ml。

1.2.1.2 缓冲溶液B:4.0 g碳酸氢铵和35 g碳酸氢钠加蒸馏水定容到1 000 ml。

1.2.1.3 常量元素C:5.7 g磷酸氢二钠、6.2 g磷酸二氢钾和0.6 g七水硫酸镁加蒸馏水定容到1 000 ml。

1.2.1.4 还原液D:氢氧化钠，0.625 0 g硫化钠加水至95 ml。

1.2.2 瘤胃液体外发酵

1.2.2.1 在培养前，配制瘤胃培养液。将400 ml蒸馏水，0.1 ml溶液A，200 ml溶液B和200溶液C，40 ml还原液D配合在一起，放在39℃的水浴锅中，然后通入二氧化碳半个小时，并用玻璃棒不断搅动培养液。

1.2.2.2 瘤胃液采集，通过羊瘤胃瘘管采集瘤胃液，置于保温杯中迅速的带回实验室，在培养液通二氧化碳半个小时后，将瘤胃液倒在4层的纱布过滤，滤出液相部分约200 ml，在将瘤胃过滤液与培养液按1:2(V:V)的比例配制人工瘤胃液，倒入容积为1 L的大烧杯中，将大烧杯放在39℃的水浴锅中持续通二氧化碳气体。

1.2.2.3 准备容量为100 ml玻璃注射器作为体外发酵管，最小的刻度为1 ml，注射器的前端要套上3～5 cm的软质橡皮管，以起到密封作用。

1.2.2.4 准确称取0.200 0 g饲料样品，再按饲料样品的重量分别称取占重量百分比的0%，1%，2%，3%，4%，5%的尿素。加入到饲料样品中，将样品缓慢倒入到发酵管的最前端。

1.2.2.5 缓慢将20 ml人工瘤胃液吸入到玻璃注射器中，再将发酵管中的空气排尽后，把注射器前端的软质橡皮管打结。

1.2.2.6 将所有的发酵管放入到水浴摇床中之后开始振荡发酵，水浴摇床的温度设置在39℃。

1.2.2.7 在实验过程中分别取发酵6 h，12 h和24 h后的发酵液进行原虫的计数工作。

1.2.3 瘤胃原虫测定

1.2.3.1 取发酵过的瘤胃培养液15 ml，用双层纱布滤去残渣，再取滤液1 ml，加入原生质染色液(MFS)4 ml(MFS:35%的福尔马林100 ml，NaCl 8.0 g，甲基绿0.6 g和蒸馏水900 ml)，混匀后静置染色半小时。原虫虫体细胞质不被MFS染色，细胞核则染为蓝绿色。

1.2.3.2 用吸管吸取样品稀释液，缓慢滴加到血球计数室，盖上盖玻片，放在光学显微镜下镜检(100X)。每个样品取10个视野。每个视野取10个方格，最后取平均数。

1.2.3.3 计算方法:原虫数/ml=X/S×D×2×1000

X:所观察的所有方格中原虫的总数

S:计数的方格数

D:稀释倍数(本实验的稀释倍数为5倍)

1.3 瘤胃液MCP的测定

1.3.1 试剂

浓硫酸(98%)、混合催化剂(0.4 g硫酸铜，6 g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀)、饱和NaOH溶液、2%硼酸、甲基红溴甲酚绿混合指示剂、0.1 mol/L盐酸标准溶液、硫酸铵。

1.3.2 MCP测定

1.3.2.1 取发酵24 h的人工瘤胃液20 ml加入到容量为50 ml洁净的离心管中进行离心，离心机转速为1 500 rpm，温度为4℃，离心20 min。

1.3.2.2 离心20 min后，取20 ml所得上清液装入容量为50 ml洁净的的离心管中(所放相对离心位置的两个离心管重量要配平)，放入离心机中进行离心。离心机转速设定:20 000 rpm，温度为4℃，离心20 min。

1.3.2.3 离心20 min后，弃去上清液，再用生理盐水冲洗离心管中的沉淀物，直到粘在离心管内壁的完全沉淀物脱落，所得冲洗液转移到装入容量为50 ml洁净的离心管中，再次离心(离心机转速20 000 rpm，温度为4℃)离心20 min。

1.3.2.4 将离心好的细胞沉淀无损的移到滤纸上，并放到烘箱中干燥6 h，烘箱温度设置为130℃(干燥前要先记录滤纸的重量)。样品干燥后称重。

1.3.2.5 样品蛋白质的测定按凯氏定氮法测定。样品经完全消煮后，用全自动凯氏定氮仪测定样品中氮的含量。

1.4 数据处理

数据经Excel进行整理后，采用SPSS13.0统计软件进行方差分析及多重比较。显著检验水平为0.05。

2 结果分析

2.1 不同浓度尿素对瘤胃MCP的影响

表2 不同浓度尿素对瘤胃MCP的影响

由表1可知，MCP含量在2%和3%尿素浓度时最高，显著高于其它各组(P＜0.05)，但2%和3%尿素浓度组之间无显著差异(P＞0.05)。4%和5%的尿素添加浓度MCP含量最低，显著低于未加尿素组和1%的尿素添加组。未添加尿素组和1%的尿素添加组，MCP含量处于同一水平，未

2.2 不同浓度尿素对瘤胃原虫数量的影响

见有显著差异(P＞0.05)。此外，表中数据还显示，尿素添加浓度在0%～3%个范围内，MCP含量随着尿素浓度的增加而增加;尿素添加浓度在3%～5%范围内，MCP含量则随着尿素浓度的增加而减少。

表3 不同浓度尿素对瘤胃6 h，12 h，24 h原虫数量的影响(×104/mL)

由表3可见:原虫数量在尿素浓度为2%和3%时显著大于其它尿素组(P＜0.05)，原虫数量在尿素浓度2%和3%之间无显著差异(P＞0.05)。未添加尿素组和1%尿素浓度组间原虫数量在同一水平，差异不显著(P＞0.05)，但二者的原虫数量均显著高于4%和5%的尿素水平添加组。在尿素浓度为0%、1%、2%和3%范围内，原虫的数量随尿素浓度水平增加而增加，之后，原虫浓度则随尿素添加浓度的增加而减少。发酵液原虫在4%和5%的尿素浓度下数量最少。此外，瘤胃原虫数量随发酵时间的增加而表现出了下降趋势。

3 讨论

3.1 尿素对瘤胃MCP含量人影响

实验结果表明，尿素浓度为3%的发酵组中MCP的含量最高，达到了1.82 mg/ml，而未加尿素对照组中MCP的含量是1.14 mg/ml，3%尿素浓度组较对照组发酵液中MCP的含量上升了59%，尿素浓度为5%发酵组MCP的含量最低是0.68 mg/ml，比对照组MCP下降了40%左右;在尿素浓度为0%，1%，2%，3%时，MCP含量随尿素含量的增加而增加。这一结果说明，一方面，饲料中添加一定量的尿素水平有利于发酵液瘤胃微生物的增殖，进而使MCP的含量有显著增加;另一方面，尿素添加浓度在4%和5%的水平，则对发酵液瘤胃微生物的增殖表现出了负面作用，这很可能是过高的尿素添加量会产生较多的氨态氮，使发酵液的pH环境发生了不利于瘤胃微生物增殖的变化而使其数量减少，致使MCP含量下降所致。研究表明，饲料中尿素的添加量控制在一定的浓度对MCP的合成量起促进作用，尿素在瘤胃内经过瘤胃内微生物的降解产生氨基酸、氨氮和有机酸等[4，5]。尿素使用量过多会使尿素降解产生的氨氮浓度上升，较高浓度的氨氮会存留在瘤胃内或进入血液中，使瘤胃内和血液中的pH值上升[6]，间接使瘤胃内脲酶的活性受到抑制，使瘤胃微生物对瘤胃内氨态氮的利用受阻，进而使MCP的合成量受到抑制[7]。当粗饲料中蛋白质来源不足时，添加一定量的非蛋白氮可显著改善瘤胃内MCP的代谢[8]，这些研究结果与本实验的结果一致。

3.2 尿素浓度与瘤胃原虫数量的关系

发酵液瘤胃原虫数量的变化规律与MCP的变化规律基本一致。一般认为，原虫对提高宿主氮的利用率和生长具有积极的促进作用[9]。原虫自身不能利用尿素分解的氨态氮合成虫体蛋白，而是通过原虫吞噬细菌获取蛋白(间接利用尿素氮)，被瘤胃原虫吞噬的细菌则可以利用尿素降解产生的氨合成细菌蛋白，合成的细菌蛋白又被原虫利用来进行自身的生长和繁殖[10]。尿素添加浓度小于3%时，发酵液细菌的数量会随尿素浓度的增加而增加，加快了瘤胃细菌的生长，这为原虫的生长和增殖提供了更多的物质基础，从而使原虫的数量有明显增加。有研究表明羊瘤胃细菌和原虫数量之间存在正相关关系[11];艾晓杰等[12]人观察了一种含铵的工业废液(ISCA)作为非蛋白氮饲料对瘤胃蛋白质代谢的影响，结果也显示非蛋白氮可以同步增加瘤胃细菌和原虫数量。这些研究结果为以上推理提供了有力的佐证。相似的原因，当尿素浓度增加至4%和5%时，发酵液中瘤胃细菌数量受到过量氨态氮的毒害作用而减少，发酵液中瘤胃原虫的数量则很可能因为吞噬细菌数量的减少，其生长和增殖受到抑制，数量显著减少。至于瘤胃原虫数量随发酵时间的增加而表现出下降趋势，其原因很可能是，随着发酵液在体外发酵时间的延长，发酵过程产生了过多的不利于瘤胃微生物增殖有害物质造成的。

4 结论

尿素浓度在0～3%范围内，MCP和原虫数量均表现出随尿素浓度增加而增加，2%和3%尿素浓度时，MCP和原虫数量均较高，显著高于1%和对照组，说明此浓度可促进瘤胃微生物的增殖;但是，MCP和原虫数量在尿素浓度为4%和5%时均有显著下降，说明尿素浓度过大则对瘤胃微生物表现出了明显的毒害作用。

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