猪GSTM2基因的多态性及与生产性状相关性分析

王嘉博，祝继原，俄广鑫，杨少成，刘 娣*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院，哈尔滨 150086）

谷胱甘肽硫转移酶 (Glutathione S-transferases；简称GSTs)是生物体内一种重要的一相解毒酶，GST mu2基因属于GSTs的mu亚型，mu亚型在消除自由基、过氧化物、亲电子基团和中间数具有酶功能，并参与细胞保护和调节细胞生长，GSTM2具有前列腺素E合成酶(PGES)的活性，可以参与前列腺素E2(PGE2)的合成[1]。有研究表明GSTM2在卵巢中表达，其意义可能在于保护卵子免受有毒物质的伤害和产生PGE2[2]。研究发现，仅在妊娠第3、4天的小鼠宫腔上皮中检测到GSTM2的表达。小鼠胚胎着床发生在妊娠第4天的子夜，妊娠第3、4天是子宫为胚胎着床的准备期，此时孕酮的含量也大量增加，在这一阶段，GSTM2高表达于腔上皮，推测该分子可能与胚胎着床时的子宫分化为接受态有关，并且可能受体内的孕酮调节。GSTM2所起作用以及作用机理有待于进一步研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PCR-SSCP用组织样：法系大白猪（50头）和大民猪（大白猪♂×民猪♀，100头）两个品种共150个母猪耳组织样，均采自黑龙江省农科院畜牧研究所。

1.2 引物设计及反应条件

根据GenBank上发表的猪GSTM2基因序列（No.DQ988118）和鼠的 GSTM2基因序列（No.BC037068），在第2、第5和第7外显子处设计3对引物（见表1）。

表1 猪GSTM2基因PCR-SSCP分析用引物Table 1 Primers for PCR-SSCP analysis on pig GSTM2 gene

1.3 扩增产物的PCR-SSCP

取2 μL PCR产物置于PCR管中加8 μL变性Buffer，混匀，98℃变性10 min，迅速插入冰中，使之保持变性状态。18%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。高压250 V预电泳5 min，然后5 V·cm-1，电泳14～16 h后，银染显色[3]。

1.4 统计分析

计算各基因型的频率和PIC（群体杂合度）值，将基因型与各个性状指标进行最小二乘分析（JMP7.0）。

用于分析的统计模型为：Y=μ+G+e其中，Y为性状的表型值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，e为剩余效应。

采用x2检验对试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 SSCP检验结果

3对引物经PCR扩增后获得各自长度的特异带，电泳结果见图1。PCR-SSCP结果见图2～4。

从图2可以看到G2位点的多态分析结果，一共6种带型，3个等位基因A、B和C。图3中G5位点的多态分析结果：3种带型，2个等位基因。图4中G7位点的多态分析结果：3种带型，2个等位基因。

图1 对引物PCR-SSCP扩增产物Fig.1 PCR-SSCP amplification products of three pairs primers

图2 G2引物PCR-SSCP检验结果Fig.2 PCR-SSCP test results of G2 primers

2.2 各基因型在2个猪种中的分布

对法系大白猪和大民猪共150个样品进行PCR-SSCP检验，得到各基因型在这两个猪种中的分布情况。从表2可见G2位点为高度多态位点，并且G2位点法系大白猪与大民猪的等位基因频率存在显著差异。其他两个位点属于中度多态位点，只有三种带型，两个等位基因。

2.3 各基因型与生产性状相关性分析

图3 G5引物PCR-SSCP检验结果Fig.3 PCR-SSCP test results of G5 primer

图4 G7引物PCR-SSCP检验结果Fig.4 PCR-SSCP test results of G7 primer

通过对150头母猪的生产性状记录、对比，将结果与基因型联系、分析。结果见表3～5。最后计算各个基因型之间生产性状的分布差异检验的P值。由此可见，G2、G5、G7位点对母猪总产仔数和活产仔数影响板显著（P＜0.01），这三个位点中都是AB基因型个体的总产仔数平均数最高，进一步验证了杂合基因型高于纯合基因型性状的理论。这个位点对断奶窝平均重影响不显著。G2位点对窝平均初生重影响显著。由表3～5可见AB型在总产仔数、活产仔数上最高且与其他基因型差异极显著。AA与BB性状表现基本一致，也进一步说明了杂合基因型优于纯合基因型。

表2 不同品种猪GSTM2基因的基因型频率和基因频率Table 2 Allele ferquencies and genotype frequencies of GSTM2 among two breeds

表3 母猪G2多态位点的各生产性状Table 3 G2 polymorphic loci in various production traits

表4 母猪G5多态位点的各生产性状Table 4 G5 polymorphic loci in various production traits

表5 母猪G7多态位点的各生产性状Table 5 G7 polymorphic loci in various production traits

3 讨论与结论

Booth J和Canbes B等先后在肝脏细胞抽提液中发现了能够催化GSH偶联到1，2-二氯-4-硝基苯的活性酶，从而开启了近40年来对谷胱甘肽硫转移酶进行比较生物化学和酶学研究的先河[4-5]。GST mu2基因是一段属于mu亚型，mu亚型在消除自由基、过氧化物、亲电子基团和中间数具有酶功能，并参与细胞保护和调节细胞生长，在人类基因组中mu亚基是在染色体的1p13.3（1号染色体短臂上的一个位置）上编码蛋白[6]。

通过参考GenBank上的GSTM2基因序列，克隆得到猪GSTM2基因序列，通过对比发现了三个多态位点，针对这三个多态位点进行了SSCP-PCR检测。G2位点，该片段中在内含子2的370 bp处以及外显子2的399 bp处存在2个核苷酸多态，其中，外显子内的多态没有导致编码蛋白改变，属于同义突变。G5位点，该片段中在外显子5的1 435 bp处存在核苷酸多态。该处突变导致终止密码子提前，终止翻译。G7位点，该片段中在外显子7的2 466、2 486 bp以及内含子2 395和2 406 bp处存在4个核苷酸多态，没有发现和网上序列一致的基因型，并通过大量测序及基因型观察，这4个核苷酸突变是基因连锁，CACA/ATTG。其中外显子突变导致蛋白质多肽链氨基酸的改变，分别是F/S、E/V。

经过SSCP检测，150个母猪中G2位点上法系大白猪B等位基因占优势，但大民猪中A等位基因占优势，G5位点上2猪种均是B等位基因占优势，G7位点上2猪种均是B等位基因占优势。各基因型与生产性状相关性分析表明，基因中G2、G5、G7各位点的AB型总产仔数都为最高，可进一步说明这三个位点的突变对母猪生产性状影响极显著。

因此，本研究认为GSTM2基因的PCR-SSCP可以作为与猪产仔数相关的遗传标记，研究GSTM2基因的多态性可以探讨GSTM2基因对于猪繁殖性状的重要意义。

[1] Janeric,Ronald W P.A glutathione transferase in human leukocytes as a marker for thesusceptibility to lung cancer[J].Carcinogenesis，1986,7(5):751-753.

[2] Richard C.S,Peter W J,Anthony A F.Glutathione S-transferase:Genetics and role in toxicology[J].Toxicology Letters,2000,112-113:357-363.

[3] 李洪敏,吴雪琼,张俊仙,等.应用PCR-SSCP快速鉴定结核分枝杆菌复合群[J].微生物学通报,2000,27(3):202～204.

[4] 杨海灵.聂力嘉,朱圣庚,等.谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究进展[J].成都大学学报,2006，3(1):19～24.

[5] 王智慧,吴逸明,吴拥军.人谷胱甘肽硫转移酶Pi基因的克隆及表达[J].医药论坛杂志.2004，25(11):6～8.

[6] Huang Jingshu,Xiong Yuanzhu.Cloning,sequence analysis and identification of a nonsense mutation-mediated mRNA decay of porcineGSTM2gene[J].ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2007,39(8):560-566.